今天为大家介绍的是来自Zilong Wu , Daniel W. Armstrong, Herman Wolosker & Yuebing Zheng团队的一篇论文。小型代谢分子的手性在控制生理过程和指示人类健康状况方面非常重要。在多种疾病中，包括癌症、肾脏和脑部疾病，生物体液和组织中手性分子的对映异构体比例会发生异常。因此，手性小分子是疾病诊断、预后、不良药物反应监测、药效学研究和个性化医疗的有前景的生物标志物。然而，由于这些小型手性分子种类繁多、浓度低，要在临床程序中实现成本效益高且可靠的分析仍然困难。
识别和检测不同的生物标志物对于疾病的诊断、评估疾病进展，乃至治疗药物的开发非常重要。小分子生物标志物（小于1000 Da）如糖类、脂肪酸和氨基酸正因“组学”革命而变得日益重要。与如蛋白质和基因材料等其他生物标志物不同，小分子不仅能反映基因组的下游结果，还能反映来自药物的上游输入。这使科学家能够监测疾病的发作和进展，以及对药物的反应。
小分子生物标志物的一个优势是它们中的许多是手性的。这类分子被称为对映异构体，可以分为“右手”和“左手”形式。人类（和其他物种）中常见的手性小分子包括碳水化合物（如葡萄糖）、有机酸（如乳酸和2-羟基戊二酸）和氨基酸（如丝氨酸、天门冬氨酸和丙氨酸）。通常，特定类型的“手性”分子在生物系统中将占据主导地位。例如，手性氨基酸主要以L-对映体存在，而碳水化合物的D-对映体在所有生物中占主导地位。这些基本的化学成分对于立体选择性蛋白质的形成至关重要。这些小分子的手性也影响生物化学过程，如分子结合、分子合成和细胞通信中的信号传导。有趣的是，小分子的手性取决于动物（包括人类）的生理状态。内部或外部的影响因素，如毒素、突变、消旋化、酶缺陷、感染和辐射，都可能引起选择性的变化，导致生物体液或组织中分子的手性异常。
由于分子手性与病理过程之间的紧密关联，越来越多的手性小分子的异常浓度被识别为疾病监测和治疗的生物标志物。例如，许多类型的癌症细胞中D-2-羟基戊二酸的对映异构体过量超过健康细胞。这些小分子可用于疾病预测，并可为最有效的治疗方法提供信息。同样，检测谷氨酰胺和异亮氨酸的D-对映体可能有助于识别早期胃癌患者进行手术或特定化疗。糖尿病并发症和败血症与乳酸的对映体有关，其测量有可能识别需要积极治疗的患者。脑疾病是另一个涉及手性小分子的主要疾病领域。例如，D-丝氨酸（D-Ser）占大脑总丝氨酸的三分之一，是一个关键神经递质受体N-甲基-D-天门冬氨酸受体的生理配体。这种D-氨基酸由丝氨酸消旋酶合成，并具有释放机制和代谢途径。D-Ser与多种疾病的病理生理学有关，包括创伤性脑损伤、中风损伤、神经精神障碍、癫痫和肌萎缩侧索硬化症，是肾病的潜在生物标志物。
疾病中的手性分子
在发现和识别手性生物标志物方面，主要有两种策略。一种是基于依赖手性的生理途径，推测现有的潜在手性生物标志物，然后通过针对性的生物标志物检测来验证这一假设。另一种策略是以非针对性的方式，识别人体内的代谢产物（其中一部分是手性小分子生物标志物）。然后通过建立代谢产物轮廓与疾病状态之间的关联来识别手性生物标志物。
脑部生理和病理
NMDARs是大脑中的主要兴奋性受体，通过谷氨酸与GluN2结合和共激动剂与GluN1亚单位结合而被激活。突触中内源性神经递质与NMDARs的结合对神经传递至关重要。NMDARs的过度刺激或低功能可能导致突触功能障碍和认知障碍。近期研究表明，某些氨基酸和手性有机酸可以对NMDARs进行选择性结合。在这一部分中，作者回顾了其中最重要的几种。
d-丝氨酸：与l-丝氨酸不同，d-Ser结合到NMDARs的共激动剂位点，导致通道激活。针对d-Ser生物合成酶丝氨酸消旋酶的定向删除会导致NMDAR低功能和行为异常，表明维持大脑中适当浓度的d-Ser对调节神经传递至关重要。然而，通过过量的d-Ser和谷氨酸过度刺激NMDARs会导致大量钙离子进入细胞，并促进神经毒性。通过NMDARs激活导致的d-Ser介导的细胞死亡与多种脑疾病相关，包括中风、癫痫、慢性疼痛、肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病。相反，由于d-Ser浓度低而导致的NMDAR低功能可能导致认知障碍，类似于精神分裂症或正常衰老。d-Ser浓度低也被报道在丝氨酸生物合成紊乱中，如3-磷酸甘油醛脱氢酶缺乏症和磷酸丝氨酸磷酸酶缺乏症。对d-Ser在这些生化过程中的作用的了解促使研究人员检测人类生物样本中的d-Ser。d-Ser被提议作为阿尔茨海默病的合适生物标志物，但目前结果并不一致。报告称，患者脑脊液中d-Ser的浓度增加，提高了阿尔茨海默病诊断的敏感性和特异性。然而，在另一组患者中观察到的变化较小或没有变化。最近，Sachi及其同事在更多受试者中发现了血清中d-Ser浓度与阿尔茨海默病患者之间的相关性。作为内部对照，他们表明d-Asp浓度在患者中不变。仍需在更大的队列中进行更标准化的技术研究，以解决使用d-Ser以及其他d-氨基酸作为阿尔茨海默病生物标志物的一些不一致性。
d-天门冬氨酸（d-Asp）：d-Asp也存在于大脑中。d-Asp主要存在于神经元中，在新生期迅速减少，这是由于其代谢酶d-Asp氧化酶的表达。d-Asp也与NMDARs的谷氨酸结合位点结合，过量时可能介导NMDAR神经毒性。转基因小鼠在产前期过量表达d-Asp氧化酶，表现出较低的大脑d-Asp和大脑形态变化，表明d-Asp在正常大脑发育中起作用。与d-Ser类似，精神分裂症患者的d-Asp浓度较低，这可能有助于疾病发展中NMDAR低功能。在帕金森病中，患者黑质中d-Asp浓度减少，这可能反映了这一区域多巴胺能神经元的丧失。尽管这些发现令人鼓舞，但将d-Asp作为生物标志物的使用还需在更大的患者队列中进行进一步研究。
d-丙氨酸和其他d-氨基酸：d-Ala是甘氨酸和d-Ser位点的NMDARs的共激动剂。然而，大脑中d-Ala的生理浓度至少比d-Ser低一个数量级，使得这种d-氨基酸与NMDARs的生理相互作用不太可能。d-Ala已作为治疗精神分裂症的治疗剂进行测试，但需要比d-Ser更高的剂量才能达到相同的治疗效果。在阿尔茨海默病患者的大脑白质中检测到更高浓度的d-Ala。然而，在阿尔茨海默病的大鼠模型中，血浆中d-Ala浓度低于对照组。在这项研究中，d-Ser、d-Asp、d-亮氨酸（d-Leu）和d-脯氨酸（d-Pro）的浓度也低于对照组，而d-苯丙氨酸（d-Phe）的浓度却增加。尽管这些观察结果表明d-氨基酸可能是阿尔茨海默病的生物标志物，但这些变化在不同疾病模型中并不一致，需要在动物和人类中进一步研究以确认。对d-氨基酸生物标志物的研究可能涉及对d-半胱氨酸（d-Cys）的研究，它是近来发现的丝氨酸消旋酶对l-半胱氨酸的主要作用产物。这种内源性d-氨基酸在新生儿大脑中含量很高，是细胞增殖的负调节因子；其作为生物标志物的潜力尚待研究。尽管近年来对d-氨基酸在神经系统中的生理和病理作用的研究取得了进展，但关于它们作为生物标志物的适用性仍有很多未知，部分原因是检测体液中少量对映异构体存在困难。
肾脏疾病和糖尿病
肾脏通过选择性地过滤和重吸收血液中的代谢物来调节脊椎动物的化学平衡。估算肾小球滤过率（GFR）作为肾功能的指标对于早期诊断和慢性肾病的随访至关重要。然而，常规实验室技术（例如，肌酐清除率）估算GFR在高GFR值时不准确，并依赖于肌肉质量。通常，l-氨基酸比d-氨基酸在近曲小管中更有效地被重吸收。d-丝氨酸在尿液中积聚，因为在氨基酸重吸收过程中l-丝氨酸会取代d-丝氨酸。在由IgA肾炎引起的肾衰竭、糖尿病肾病、高血压肾病和系统性红斑狼疮中发现血浆中d-丝氨酸增加。例如，在一例由系统性红斑狼疮引起的急进性肾小球肾炎病例中，患者血浆中的d-丝氨酸浓度极高，在急性期占全血丝氨酸的19%。血浆中d-丝氨酸的浓度与实际GFR更好地相关，这在这些疾病中降低，并且独立于影响常规实验室技术的常见临床因素，如肌肉质量、年龄和性别。监测尿液中的d-丝氨酸与l-丝氨酸比例而不是血浆中的比例在检测肾衰竭方面具有优势。在急性肾缺血模型中，测量尿液中的d-丝氨酸与l-丝氨酸比例比血清中的比例和所有其他常用实验室检测更敏感，以检测肾功能障碍。因此，对于肾缺血，测量d-丝氨酸可能提供一个有用的临床标志物，优于常规检测，前提是体液中对映异构体检测技术普遍可用。值得注意的是，其他d-氨基酸，如d-苯丙氨酸、d-酪氨酸、d-天门冬氨酸和d-脯氨酸在慢性肾损伤中血浆中的浓度也会增加，可能代表新的疾病生物标志物。
癌症
癌细胞的生长受到细胞内外环境的极大影响。代谢分析显示了某些d-氨基酸的异常浓度，以及它们作为不同癌症类型生物标志物的潜力。例如，胃液中d-氨基酸（如d-丙氨酸和d-脯氨酸）的浓度升高与早期胃癌有关。相比之下，肝细胞癌患者血清中的其他d-氨基酸（如d-谷氨酸和d-谷氨酰胺）浓度降低。对人乳腺癌细胞（MCF-7）和非肿瘤性人乳腺上皮细胞（MCF-10）的代谢分析显示，MCF-7中某些d-氨基酸（包括d-天门冬氨酸和d-丝氨酸）上调。某些癌细胞中d-天门冬氨酸和d-丝氨酸的浓度被认为是由丝氨酸消旋酶合成和从细胞外介质吸收控制的。丝氨酸消旋酶在结肠腺瘤和腺癌中上调，它产生d-丝氨酸，还通过将丝氨酸脱水为丙酮酸促进癌细胞生长。许多其他癌症类型上调丝氨酸消旋酶mRNA，但丝氨酸消旋酶和d-丝氨酸作为生物标志物或在这些肿瘤的病理中的作用仍待研究。癌细胞还过度表达中性氨基酸转运蛋白，如ASCT2（也称为SLC1A5）、SNAT1（也称为SLC38A1）和SNAT2（也称为SLC38A2）。除了对癌细胞生长所需的l-谷氨酰胺外，这些转运蛋白还可以使用d-丝氨酸作为底物，并将d-丝氨酸转运进入细胞。在高细胞内浓度下，中性d-氨基酸被d-氨基酸氧化酶（DAAO）降解为过氧化氢、氨和相应的α-酮酸。鉴于过氧化氢的细胞毒性，提出了使用d-氨基酸治疗癌细胞以抑制癌细胞生长的策略。然而，这种酶主要在肾脏、肝脏和小脑中表达，关于其在不同癌细胞中的酶活性信息很少。癌细胞中d-氨基酸的积累表明癌组织中DAAO的内源性降解较低。
临床应用上的困难
临床检测中的困难：人体中存在成千上万种不同的手性小分子。一种能够特异性和准确性地检测尽可能多的这些分子的技术对于提高疾病诊断和预后的多重手性分析是非常可取的。然而，这些分子在分子属性（例如，电荷、质量和官能团）上的大量变化使得单一技术难以普遍适用于所有相关物种。此外，取决于物种和检测方法，分析物可能以原生态或衍生化形式进行分析。有许多可用的衍生化试剂，每种试剂在提取和富集、手性分离和兼容检测方法方面都有优缺点。尖端代谢组学技术的有效动态范围几乎是五个数量级。然而，这对于一些小手性分子的定量仍然不足，其浓度范围可能超过五个数量级。
临床样本中的低浓度：许多手性小分子在人体生物液体中以微摩尔或更低浓度存在，这需要使用高度灵敏的检测技术。此外，正常状态和疾病状态间手性生物标志物的变化可能很小，特别是在疾病的早期阶段。例如，健康受试者和癌症患者血浆中的l-2-HG平均浓度可能仅相差0.2 μM。因此，在这些情况下检测0.2 μM或更低的对映异构体浓度变化对于疾病的早期诊断和预后至关重要。这个检测限对于某些现有技术（例如，旋光度测量法，几乎无法量化低于1 μM的浓度；以及圆二色谱法）来说是一个挑战。临床样本中高浓度的盐和其他成分可能会干扰低浓度手性小分子的检测。不良的样品制备和富集技术可能导致低浓度代谢物的损失或其相对浓度的变化，从而导致低检测灵敏度和/或生物样本中目标代谢物的不准确测定。
检测频率和高成本：对于某些疾病，通过检测手性生物标志物进行诊断、治疗监测和预后将需要长期和频繁的检测。例如，在一项对小鼠的研究中，40小时的常规手性检测深化了对肾衰竭病理生理和生化后果的理解。然而，尚未在人类受试者上进行类似的常规手性检测，且对此类测试的标准化频率和方法尚无共识。考虑到慢性肾病和癌症的常规检测频率，手性检测的潜在频率可能在0.5至1年之间变化，或根据疾病严重程度更频繁。为了检测低浓度（例如，<1 μM）的手性分子，可能需要昂贵的仪器（例如，液相色谱-串联质谱），以实现高灵敏度（达到皮摩尔）和选择性（多达18种手性氨基酸）。当涉及到某些癌症和糖尿病等慢性疾病时，每个个体需要分析的样本数量可能很大，考虑到治疗的长期性和复发的可能性。这导致了高昂的检测成本。需要巨大努力开发高通量技术，以更低的成本常规准确地检测手性生物标志物，以减轻患者和卫生系统的经济负担，同时增加患者的可及性。
编译 | 曾全晨
审稿 | 王建民
参考资料
Liu, Y., Wu, Z., Armstrong, D.W. et al. Detection and analysis of chiral molecules as disease biomarkers. Nat Rev Chem 7, 355–373 (2023).
https://doi.org/10.1038/s41570-023-00476-z
