摘要：
本综述总结了当前冷冻电子显微镜（Cryo-EM）成像在分子、细胞和结构生物学家中所能达到的方法和结果，这对于希望理解所需条件以及该如何帮助解答他们的研究问题的人来说很有用。它涵盖了样本准备、显微镜和数据收集、图像处理、三维（3D）的主要问题。
引言：
分子和细胞生物学中的冷冻电子显微镜技术现状
经过数十年的渐进发展，冷冻电子显微镜（cryo-EM）成像技术终于引起了更广泛的结构生物学家和细胞生物学家的关注，这在以前只是由一小部分专家所关注的领域。这场热潮大约在2012年开始，那时直接电子探测器出现，加上软硬件的其他先进技术，使这个领域迅速进入了高分辨率的生物分子结构研究，包括那些过去难以解析的大分子结构。许多优秀的评论都已经介绍了这些进展，例如Lyumkis（2019年），Danev等人（2019年），Nogales（2016年），Ko ̈ning等人（2018年），Pfeffer和Mahamid（2018年），Turk和Baumeister（2020年），Wu和Lander（2020年），以及Glaeser等人（2021年）。这个领域的历史从其三位最近的诺贝尔奖获得者的视角，都在他们的诺贝尔讲座（Henderson，2018年；Frank，2018年；Dubochet，2018年）中生动地展现出来。在这里，我总结了使用冷冻电子显微镜进行大分子结构测定的关键步骤的现阶段发展情况，包括纯化复合物的体外研究，和细胞环境中的体内研究。对于独立的模型复合物，不断的进步已经将这个领域推向了真正的原子级分辨率，而体内的结构分析也正在稳步跟进。体外和体内的方法在样本准备和数据收集上有一些不同的要求，但他们的数据分析流程正在逐渐汇聚。这些将在本次评论中并行考虑。
样本准备
第一步且最重要的步骤是提出生物学问题，确定并隔离感兴趣的目标，无论它是生化纯化的分子组合，亚细胞部分，还是细胞样本。晶体学家会欣赏到，电子显微镜需要的样本量相对较小，不需要晶体（电子晶体学对非常薄的微晶体非常有效[Mu等，2021年]；这篇回顾集中在成像方法上）。尽管冷冻电子显微镜可以解析比X射线晶体学更复杂的样本，但样本的纯度和稳定性越高，后续的步骤就越快，越直接。然而，样本的异质性通常对于理解大分子机器的功能至关重要，发展出更好的方法来区分多种构型是一个令人兴奋的发展领域。通过色谱法、凝胶电泳和负染色电镜常常检查单个粒子样本的纯度和完整性，这可以快速检查粒子特征和均匀性。对于负染色，样本在重金属盐的膜中干燥，这可以保留整体形状，给出结构的印象，尽管在一些情况下它可能会损害或破坏结构。
对于透射电子显微镜，关键要求是样本必须足够薄，以便大多数电子要么未经偏转地穿过，要么与样本发生一次交互。对于3D重建，需要一组在不同方向的视图（粒子或感兴趣的结构的2D投影）。理想的冷冻电子显微镜样本具有刚好足够厚的冰层来包含感兴趣的结构，理想情况下<50-100纳米，尽管可以对高达数百纳米的较大结构和细胞样本进行成像。作为比较，A4/信纸的长度到厚度比约为1000³；对于冷冻电子显微镜样本，这个比例是10,000³。这种薄片几何形状带来了巨大的各向异性 - 不同于医学计算机断层扫描，在其中大致为圆柱形的病人可以从其轴线周围的所有角度进行X射线扫描，当样本相对于照明光束倾斜超过大约60度时，通过薄片单粒子样本在电子显微镜栅格上呈现出优选取向时也会出现这个问题，这是一种常见的情况。修改粒子取向分布的实验方法包括添加如洗涤剂等添加剂，使用不同的支撑膜和/或不同的冷冻设备，如下文所述。
生物冷冻电子显微镜的主要创新是使用玻璃化，通过快速冷冻将生物样本困在冻结的水合状态中，其中水以玻璃化状态固化，不形成冰晶(Dubochet等，1988)。在其最常见的形式中，复合物的溶液手动施加到支撑栅格上，通过吸去多余的液体形成薄层，只留下0.1皮升的样本在栅格上，然后立即将其浸入液态冷却剂，通常是乙烷。玻璃化栅格必须保持液氮冷却，以防止玻璃冰重新结晶化。处理玻璃化样本需要专门的训练和处理、存储和传输设备，但它有巨大的优势，使水合状态的样本能够承受电子显微镜柱的高真空，并减慢电子束的辐射损伤效应，这是数据收集的主要限制。有几种常用的机器人设备提供环境湿度控制，并自动化栅格吸湿和浸入冷却剂的时间。Thermo Fisher Scientific Vitrobot从两侧吸湿，Leica快速冷冻器进行单面吸湿，这对于直接在电子显微镜栅格上培养的细腻细胞样本有利。
由于未染色的生物样本提供的振幅对比度很小，因此在溶液分布在支撑膜上的孔洞处成像是理想的。孔可以在方便自动化数据收集的规则阵列中蚀刻(图1A)。然而，这种超薄液层存在困难；蛋白质迅速分配到空气-水界面(Glaeser，2021年)。这可能引起严重的问题，如高度优选的取向，甚至是粘附蛋白的变性。添加非常薄的碳层、石墨烯或氧化石墨烯到多孔栅格上，以及对这些表面的不同处理，可以缓解这些问题的一部分（综述，请参见Drulyte等人[2018]）。向栅格提供溶液样本的创新非常适合某些样本。使用喷墨或类似的技术，高速喷雾设备用于将微小的液滴分散到栅格上，然后它们落向冷却剂，从而将样本应用和冷冻之间的时间缩短到10-100毫秒范围（综述，请参见Klebl等人，2020年）。这与栅格的新设计结合在一起，栅格上生长出纳米线，形成自吸收栅格，最初在Carragher实验室开发(Razinkov等人，2016；Noble等人，2018)，现在由SPT Labtech市售。尽管昂贵，但这种方法可能非常有益。(喷雾方法也提供了快速混合流体流以促进动态研究的时间分辨电子显微镜的激动人心的可能性[Ma€eots等人，2020年])。如果这些方法都不可行，优选取向可以通过倾斜栅格进行数据收集来减小，这将减小丢失信息的区域(Tan等人，2017年)。倾斜会导致一些分辨率的损失，因为倾斜的样本有效地变得更厚，但可能比高各向异性给出更好的结果。每个样本的行为都不同，项目开发经常涉及大量的试验和错误，涉及栅格类型和玻璃化协议，导致样本制备和优化的瓶颈。通过引入100 keV场发射枪显微镜，筛选冷冻栅格的速度将加快，理想的是具有多样本处理能力，这应该比用于高分辨率数据收集的300 keV显微镜对单个实验室更加负担得起(Naydenova等人，2019年)。
虽然纯化组件的冷冻电子显微镜继续推动可实现分辨率的边界，但对结构细胞生物学的关注度越来越高，因为细胞样本准备的方法逐渐成熟(图1B)。薄的贴壁细胞或小的细菌细胞可以直接在电子显微镜栅格上快速冷冻，但只有薄的区域(<1 mm)可以成像。这排除了真核细胞的核内和核周围的区域。玻璃化更对于结构性细胞生物学，当前的首选方法是聚焦离子束（FIB）铣削，在这种方法中，通过用离子束剥离上下区域，从冻结的细胞或组织样本中切出一层材料，称为层片（参见Pfeffer和Maha- mid，2018年中的引文）。这必须在双束扫描电子显微镜中进行，其中扫描引导离子铣削。需要增加的冷冻样品转移增加了引入污染和损害的风险，但FIB铣削的层片通常表现出极佳的结构保护。到目前为止，大部分FIB铣削都在薄贴壁细胞上进行，以避免高压冷冻和从冻结块中提取区域（"提取"）。但对于更厚的细胞区域和多细胞样本，快速冷冻并不能完全防止冰晶化，而且只能在EM栅格上生长或贴附的培养细胞的限制排除了许多重要的生物学问题。已经证明，从高压冷冻块中提取然后铣削原则上是可行的，但远非常规操作（Schaffer等人，2019年）。另一种避免提取溶液或悬浮样品的高压冷冻方法，即华夫方法，将栅格方格填充高浓度样品以进行直接铣削（Kelley等人，2021年）。寻找感兴趣的区域也是一个主要的挑战。这在后面关于相关光学和电子显微镜的部分中会讨论。无论是对于快速冷冻还是高压冷冻，贴壁细胞都可以使用微图案化栅格精确地定位到支持膜的孔中（Toro-Nahuelpan等人，2020年）。
未完待续
文章来源：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.12.016
