摘要
现在有越来越多的证据表明，液-液相分离（LLPS）是细胞中无膜区域形成的基础。这个认识激发了大量的努力，以描绘这种生物分子凝聚体在正常细胞中的功能，以及它们在从发育到与年龄相关的疾病等各种环境中的角色。人们对理解这些生物凝聚体的基础生物物理原理和特性，以及将这些理解应用到各种生物过程和系统中，有着极大的兴趣。涉及到LLPS的生理和病理环境的爆炸性增长，需要对其研究有明确的标准。在这里，我们提出了对LLPS过程在体外和细胞内进行严格实验特性化的指导方针，讨论了常见实验方法的注意事项，并指出了该领域的实验和理论上的空白。
背景
早在19世纪30年代，就描述了像核仁这样的无膜区域。现在有越来越多的证据表明，液-液相分离（LLPS）或凝聚是细胞中如核仁等无膜体的形成基础。通过LLPS过程形成的细胞区域的数量正在迅速增长，并涉及到无数的细胞功能。除了点状的无膜体外，其他亚细胞结构也通过LLPS形成，并共享相似的相互作用和物理属性。这些结构包括异染色质，核孔复合物中的运输通道，以及细胞膜上的膜受体簇。通过凝聚形成的区域最近被称为“生物分子凝聚体”。认识到LLPS可以驱动区域化，扩大了我们对细胞生物学的理解，并激发了大量的努力来描绘无膜区域的功能。
通过研究这些凝聚体，我们也对疾病的分子基础有了更深入的理解。这个领域早期的工作主要集中在压力颗粒对细胞存活的影响以及它们与肌萎缩侧索硬化症（ALS）发展的联系。压力颗粒蛋白形成液态凝聚体，这些凝聚体可以成熟和固化，也就是说，它们可以经历液态到固态的转变，或者可以引发聚集。与疾病相关的突变加速了这种转变。白内障发展与LLPS的联系已经在三十多年前就被发现了，随着人们普遍认识到LLPS可能有利于聚集，我们现在可以更详细地了解与年龄相关的疾病发生和进展的分子机制。因此，与神经退行性疾病和衰老相关的病理过程也被重新视为LLPS驱动过程的表现。越来越明显的是，理解生物分子凝聚体形成的基础生物物理原理对于研究广泛的生物过程和系统的生理学和病理生理学至关重要。
随着不同无膜区域和与LLPS相关的蛋白质的快速识别，我们有责任严格地描述生物相分离。在体外展示的蛋白质或一组蛋白质的性质并不能总是推断出在细胞中与LLPS相关的功能。我们应该提出这样的问题，即在体外观察到的相分离过程是否与正在研究的生物过程相关。在这里，我们提出了对LLPS过程在体外和细胞内进行严格实验特性化的指导方针，讨论了常见实验方法的注意事项，并指出了该领域的实验和理论上的空白。我们认为体外实验是在缓冲液中组合最小的组分以复制LLPS，而体内实验是在细胞或动物中进行的研究。重要的是，许多建议都源于我们在实验室中处理相分离系统的经验。因此，我们的目标是为研究LLPS提供一个实用的入门指南，而不是对相分离概念的完整描述。对于更详细的生物物理描述和对可用的实验和理论方法的详尽覆盖，我们将引导感兴趣的读者参考已经发表的文献。
液-液相分离（LLPS）是什么？
当蛋白质或核酸等大分子的溶液经历LLPS时，它们会凝聚成一个密集的相，这个相通常类似于液滴，而这个密集的相与稀薄的相共存（如图1A，底部）。LLPS背后的驱动力是在这个过程能量有利的条件下，大分子/水相互作用被大分子/大分子和水/水相互作用所取代。LLPS的热力学驱动力的讨论以及多价相互作用如何影响这个过程的框架已经在其他地方提出过。重要的是，一个溶液是否经历相分离强烈地依赖于大分子的浓度和身份，以及溶液和环境条件，包括温度，盐的类型和浓度，共溶剂，pH值，以及其他大分子排斥的体积。因此，大分子经历了刺激响应的相分离。
相图是通过实验生成的，这些实验定义了产生单一，混合良好的相的条件集，以及促进相分离的条件（如图1）。生成相图涉及到系统地改变两个条件，例如，浓度和盐，并评估在哪些条件下可以检测到密集的相。如果一个系统处于两相区域，也就是说，如果轻相和密集相是共存的，那么所谓的联线就是由在给定条件下的轻相和密集相的浓度连接起来的。在一个单一的联线上的所有条件都会产生具有固定稀薄相和密集相浓度的两相系统；只有两相的体积分数相对于彼此改变（如图1A，底部）。在共存线，或者说双曲线内，存在一个第二条线，即旋曲线（如图1B）。旋曲线指示出系统必须通过旋曲分解进行分离的不稳定区域。在双曲线和旋曲线之间的区域，系统在成核时分离（如图1B，底部）。生成相图可以提供强大的洞察力，例如分子的价数和化学性质如何调节相分离，以及在生理相关的环境中是否可以发生相分离。需要注意的是，相图中捕获的简化密度转变可能并不能准确地表示在复杂的细胞环境中发生的情况。由于细胞中大分子的高浓度，分子的密度可能不会改变，而只是它们的空间分布可能会改变。
液体、固体和凝胶都可以从LLPS中产生
越来越明显的是，LLPS可以在细胞中产生各种物质状态的组合。如果由LLPS产生的组合是液体，这意味着长程的分子无序和只有短程的有序；也就是说，在分子的前几层，它们的排列是规则的，但在更远的地方，分子的取向和距离的变化增加。液体组合可以融合、合并和滴落，这些都是液体的典型的突现性质，并由它们的表面张力决定。如果密集相具有液体样的性质，聚合物分子通常在密集相内部和密集相与轻相之间是可移动的。通过LLPS形成的凝聚相的形成通常是可逆的。然而，凝聚体也可以经历进一步的转变，例如，凝胶转变，特别是如果它们存在于两相区域的深处，远离双曲共存线（即，在高淬火深度）。它们可以进一步转变为由类淀粉样纤维形成的水凝胶，这些纤维通常是不可逆的，或者需要改变条件，如高盐或变性剂才能溶解。这些转变的驱动力可能是序列编码的，有越来越多的证据表明，单个蛋白质序列已经进化出利用液态到固态转变的功能。一个例子是酵母蛋白Pab1，在热休克细胞中经历LLPS并形成非动态的，玻璃状的组合，这可能是适应性的。考虑到这些可能的转变，LLPS并不一定要产生液态的，自由融合的组合；相反，生物分子凝聚体可以采用一系列的物质性质。
（未完待续）
文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.035
