生
化
小
课
医学生：生理生化 必有一挂
生科/生技：生化书是我见过最厚的教材
没有之一
每周一堂
生化小课
—— 期末/考研 逢考必过——
未分离蛋白是根据其功能进行检测和定量的
为了纯化蛋白质，必须有一种方法在程序的每个阶段都存在许多其他蛋白质的情况下检测和量化该蛋白质。纯化的一个共同目标是一种或另一种称为酶的蛋白质（第 6 章）。每种酶都催化一种特定的反应，将一种生物分子（底物）转化为另一种（产物）。给定溶液或组织提取物中蛋白质的量可以根据酶产生的催化作用来测量或分析，也就是说，当酶存在时，其底物转化为反应产物的速率增加。为此，研究人员必须知道（1）催化反应的总体方程，（2）确定底物消失或反应产物出现的分析程序，（3）酶是否需要辅因子如金属离子或辅酶，（4）酶活性对底物浓度的依赖性，（5）最佳pH，以及 (6) 酶稳定且具有高活性的温度区域。酶通常在其最佳pH值和25至38℃的适宜温度下进行测定。此外，通常使用非常高的底物浓度，因此实验测量的初始反应速率与酶浓度成比例（第6章）。
根据国际协议，大多数酶的1.0单位酶活性被定义为在最佳测量条件下，在25°C下，每分钟导致1.0μmol底物转化为产物的酶的量（对于许多酶来说，这个定义是不方便的，单位的定义可能不同）。活性是指溶液中酶的总单位。比活性是每毫克总蛋白质所含的酶单位数（图3-22）。比活性是衡量酶纯度的指标：它在酶纯化过程中增加，当酶是纯的时达到最大和恒定。
在每个纯化步骤之后，测定制剂的活性（以酶活性为单位），独立测定蛋白质总量，两者的比率给出比活性。活性和总蛋白通常随着每一步而降低。由于失活或与溶液中色谱材料或其他分子的非理想相互作用，总有一些损失，因此活性降低。总蛋白减少是因为目标是尽可能多地去除不需要的或非特异性蛋白。在一个成功的步骤中，非特异性蛋白质的损失远大于活性的损失；因此，即使总活性下降，特定活性也会增加。数据汇总在类似于表 3-5 的纯化表中。当进一步的纯化步骤无法增加比活性并且只能检测到单一蛋白质种类时（例如，在存在SDS的情况下通过电泳），通常认为蛋白质是纯的。
对于不是酶的蛋白质，需要其他定量方法。转运蛋白可以通过其与转运分子的结合进行检测，激素和毒素可以通过其产生的生物效应进行检测；例如，生长激素会刺激某些培养细胞的生长。一些结构蛋白占组织质量的很大一部分，无需功能测定即可轻松提取和纯化。这些方法和蛋白质本身一样多种多样。
处理蛋白质
SUMMARY 3.1 Working with Proteins
> 蛋白质是根据其性质的不同而分离纯化的。蛋白质可以通过pH值或温度的变化选择性地沉淀，特别是通过添加某些盐。广泛的色谱程序利用大小、结合亲和力、电荷和其他性质的差异。这些包括离子交换，尺寸排除，亲和和高效液相色谱。
> 出于分析目的，电泳根据质量或电荷分离蛋白质。SDS凝胶电泳和等电聚焦可以单独使用或组合使用，以获得更高的分辨率。
> 所有纯化程序都需要在存在其他蛋白质的情况下对感兴趣的蛋白质进行定量或分析的方法。可以通过测定比活性来监测纯化。
Principles of Biochemistry
本栏目信息及图片均来源于Lehninger Principles of Biochemistry 第八版，其中文字信息为英文原版的小编翻译/整理版，仅供学习交流使用，欢迎在留言区或私信听课君提供宝贵意见，如有侵权请联系删除。
Chapter Review部分未纳入翻译整理范围，如有需要建议参考原版图书该部分内容学习。
