一、数据下载
1.加载我们将要使用的R包
代码语言：javascript复制library(GEOquery)2.先去网页确定是否是表达芯片数据，不是的话不能用本流程。
代码语言：txt复制gse_number = "GSE56649"
eSet <- getGEO(gse_number, destdir = '.', getGPL = F)#getGEO有从GEO中下载数据到工作目录下，并将数据读取到R中。#若网络不好，下载数据慢，可以换一个R包
代码语言：txt复制library(AnnoProbe)
gse_number = "GSE56649"
eSet=geoChina(gse_number)3.查看数据
代码语言：txt复制 class(eSet)#列表
length(eSet)#列表的长度
eSet = eSet[[1]]
exp <- exprs(eSet)#(1)提取表达矩阵exp
dim(exp)#矩阵几行几列
exp[1:4,1:4]#看数据是否正常，看数据是否取过log,如果取过log，则数据在0~20中间差不多。还可以画箱线图看是否正常，正确情况下每个样本的整体都差不多。#若数据没有取log
代码语言：txt复制exp = log2(exp 1)#之所以要 1是因为害怕exp有数据=0，这样log2(0)就是负无穷了。
boxplot(exp)二、提取临床信息
代码语言：txt复制 pd <- pData(eSet)三、让exp列名与pd的行名顺序完全一致
分组信息的每一列与表达矩阵的每一行是对应关系
代码语言：txt复制p = identical(rownames(pd),colnames(exp));p#判断两个数据的行名和列名是否一致
if(!p) exp = exp[,match(rownames(pd),colnames(exp))]#如果不一致，进行该行操作。四、提取芯片平台编号
代码语言：txt复制gpl_number <- eSet@annotation;gpl_number#提取的符号有@和$，该用哪个，我们可以一一试一试。
save(gse_number,pd,exp,gpl_number,file = "step1output.Rdata")#保存编号，ges_number是保存总的样本集编号，pd是临床信息，exp是表达矩阵、gpl_number是芯片平台编号五、Group(实验分组)和ids(探针注释)
代码语言：javascript复制load(file = "step1output.Rdata")
library(stringr)标准流程代码是二分组，多分组数据的分析后面另讲
生成Group向量的三种常规方法，三选一，选谁就把第几个逻辑值写成T，另外两个为F。如果三种办法都不适用，可以继续往后写else if
代码语言：txt复制 if(F){
# 1.Group----
# 第一种方法，有现成的可以用来分组的列
Group = pd$`disease state:ch1` #这个`是在我们提取的一列名称中有空格时，R语言会自动生成`
}else if(F){
# 第二种方法，自己生成 有风险，可能会数错数！
Group = c(rep("RA",times=13),
rep("control",times=9))
Group = rep(c("RA","control"),times = c(13,9))
}else if(T){
# 第三种方法，使用字符串处理的函数获取分组 比较万能，只要两个分组中可以有一个明确的字符串来检测就可以
Group=ifelse(str_detect(pd$title,"control"),#str_detece是检查是否有这个字符串的意思，如果有是T，如果没有是F
"control",#ifelse是如果括号中的检测结果是T，则用control替换T，否则用RA替换F
"RA")
}
需要把Group转换成因子，因子相比group里的字符串少了双引号，并设置参考水平，指定levels，对照组在前，处理组在后
代码语言：txt复制Group = factor(Group,levels = c("control","RA"))# 如果不加level，那么将按因子名字的首字母排序
Group六、探针注释的获取
捷径
代码语言：txt复制library(tinyarray)
find_anno(gpl_number) # 打出找注释的代码，根据gpl_number来找探针序号所对应的真正的探针基因序列
ids <- AnnoProbe::idmap('GPL570')四种方法：
方法1 BioconductorR包(最常用)
http://www.bio-info-trainee.com/1399.html 在里面找自己想找的gpl_number,然后找到对应的R包，下载该R包（记住R包后面是.bd）
代码语言：txt复制if(!require(hgu133plus2.db))BiocManager::install("hgu133plus2.db")
library(hgu133plus2.db)
ls("package:hgu133plus2.db") # 查看该包里面有什么
ids <- toTable(hgu133plus2SYMBOL)# symbol代表的是探针的ID和基因symbol，toTable是提取
head(ids)方法2 读取GPL网页的表格文件，按列取子集
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL570
代码语言：txt复制if(F){
b = read.delim("GPL570-55999.txt",
check.names = F,
comment.char = "#")# read.delim是读取该文件
colnames(b)
ids2 = b[,c("ID","Gene Symbol")]#提取列
colnames(ids2) = c("probe_id","symbol")#修改列名
k1 = ids2$symbol!="";table(k1)#去掉表格中的有空格的那一行，说明该探针没有对应的基因
k2 = !str_detect(ids2$symbol,"///");table(k2)# 去掉表格中一个基因对应多个探针的那一行，///代表把两个基因分隔开
ids2 = ids2[ k1 & k2,]
}方法3 官网下载注释文件并读取
http://www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx?product=hg-u133-plus
方法4 自主注释
https://mp.weixin.qq.com/s/mrtjpN8yDKUdCSvSUuUwcA
保存
代码语言：javascript复制save(exp,Group,ids,gse_number,file = "step2output.Rdata")七、PCA图
代码语言：txt复制dat=as.data.frame(t(exp))#转置，将数据框的横纵左边转置变成矩阵，之后再as.data.frame转成数据框
library(FactoMineR)
library(factoextra)
dat.pca <- PCA(dat, graph = FALSE)
pca_plot <- fviz_pca_ind(dat.pca,
geom.ind = "point", # show points only (nbut not "text")
col.ind = Group, # color by groups
palette = c("#00AFBB", "#E7B800"),
addEllipses = TRUE, # Concentration ellipses
legend.title = "Groups"
)
pca_plot
save(pca_plot,file = "pca_plot.Rdata")八、热图
比较的应该是每行固定基因在不同样本中的表达量差异。用标准差大的基因进行画图，聚类和分组的差别可能会大一些，但若选择表达差异大的基因，聚类和分组会更一致。
代码语言：txt复制cg=names(tail(sort(apply(exp,1,sd)),1000))# 把标准差最大的1000个基因挑选出来，标准差大不一定是差异基因，只能代表其是活跃基因
n=exp[cg,]library(pheatmap)
annotation_col=data.frame(group=Group)#增加热图上的分组条
rownames(annotation_col)=colnames(n)
pheatmap(n,
show_colnames =F,
show_rownames = F,
annotation_col=annotation_col
cluster_cols=F# 意思是不进行聚类，热图的顺序就是分组的顺序
)#这样得到的热图是表达矩阵里的所有数据都进行作图按行标准化
代码语言：javascript复制pheatmap(n,
show_colnames =F,
show_rownames = F,
annotation_col=annotation_col,
scale = "row",
breaks = seq(-3,3,length.out = 100)#设置色带分布范围，从-3到3，等差数列增加，形成100个色带值
) #一般设置色带分布范围不能太大，这样太离群的数据会被突出显示，而正常数据差异区分的不明显。
dev.off()九、差异分析
差异分析，用limma包来做，DEG：差异表达基因
需要表达矩阵和Group
代码语言：javascript复制library(limma)
design=model.matrix(~Group)
fit=lmFit(exp,design)
fit=eBayes(fit)
deg=topTable(fit,coef=2,number = Inf)
#这几行代码是做差异分析的，不需要改的，直接用为deg数据框添加几列
1.加probe_id列，把行名变成一列
代码语言：javascript复制library(dplyr)
deg <- mutate(deg,probe_id=rownames(deg))2.加上探针注释
代码语言：javascript复制ids = ids[!duplicated(ids$symbol),]# 或者用这种随机去重方式ids = diatinct(ids,symbol,.keep_all=T)
#其他去重方式在zz.去重方式.R
deg <- inner_join(deg,ids,by="probe_id")
nrow(deg)若一个基因对应多个探针，解决办法有：
1.随机去重（推荐使用）
2.保留行和/行平均值最大的探针
3.取多个探针的平均值
3.加change列,标记上下调基因,用ifelse
代码语言：javascript复制logFC_t=1
p_t = 0.05 #设置logFC和p-value的阈值，把阈值调大一些，差异基因的数量就会相对增加一些
k1 = (deg$adj.P.Val < p_t)&(deg$logFC < -logFC_t)#这里用agj.p.value做纵坐标
k2 = (deg$adj.P.Val < p_t)&(deg$logFC > logFC_t)#k1是下调基因的条件，k2是上调基因的条件
deg <- mutate(deg,change = ifelse(k1,"down",ifelse(k2,"up","stable")))
table(deg$change)4.加ENTREZID列，用于富集分析
symbol转entrezid用的是bitr，然后inner_join），基因的命名有很多种，常见的有GeneSymbol、ENSEMBLID、EntrezID等，为了在不同的基因命名方式之间快速转换，使用OrgDb。
代码语言：javascript复制library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
s2e <- bitr(deg$symbol,
fromType = "SYMBOL",
toType = "ENTREZID",
OrgDb = org.Hs.eg.db)#人类
deg <- inner_join(deg,s2e,by=c("symbol"="SYMBOL"))#将增加的那一列添加到表达数据框中，by=c(a,b)是Merge的两个数据框中列名的大小写不一样，这个操作是统一大小写
save(Group,deg,logFC_t,p_t,gse_number,file = "step4output.Rdata")其他物种http://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___OrgDb
十、火山图
代码语言：javascript复制library(dplyr)
library(ggplot2)
p <- ggplot(data = dat,
aes(x = logFC,
y = -log10(adj.P.Val)))
geom_point(alpha=0.4, size=3.5,
aes(color=change))
scale_color_manual(values=c("blue", "grey","red"))
geom_vline(xintercept=c(-logFC_t,logFC_t),lty=4,col="black",linewidth=0.8)
geom_hline(yintercept = -log10(p_t),lty=4,col="black",linewidth=0.8)
theme_bw()
p
dat = deg[!duplicated(deg$symbol),]#去重复
for_label <- dat%>%
filter(symbol %in% c("HADHA","LRRFIP1"))#选择标记到图上的基因
volcano_plot <- p
geom_point(size = 3, shape = 1, data = for_label)
ggrepel::geom_label_repel(
aes(label = symbol),
data = for_label,
color="black"
)
volcano_plot十一、差异基因热图
代码语言：javascript复制load(file = 'step2output.Rdata')
# 表达矩阵行名替换
exp = exp[dat$probe_id,]
rownames(exp) = dat$symbol#把探针的id换成基因的名字
if(T){
#取前10上调和前10下调
library(dplyr)
dat2 = dat %>%
filter(change!="stable") %>%
arrange(logFC)
cg = c(head(dat2$symbol,10),#前10个
tail(dat2$symbol,10))#后10个
}else{
# 全部差异基因
cg = dat$symbol[dat$change !="stable"]
length(cg)
}
n=exp[cg,]
dim(n)
# 差异基因热图
library(pheatmap)
annotation_col=data.frame(group=Group)
rownames(annotation_col)=colnames(n)
heatmap_plot <- pheatmap(n,show_colnames =F,
scale = "row",
#show_rownames=F,这行代码是运行全部差异基因时，去掉热图上基因的名字，要不然都叠到一起了
#cluster_cols = F, 这行代码是把聚类和分组对应
annotation_col=annotation_col,
breaks = seq(-3,3,length.out = 100)
)
heatmap_plot拼图
代码语言：javascript复制library(patchwork)
volcano_plot heatmap_plot$gtable#热图和火山图拼到一起十二、感兴趣的基因相关性
代码语言：javascript复制library(corrplot)
g = sample(deg$symbol[1:500],10) # 这里是随机取样，注意换成自己感兴趣的基因，从前500行中随机取10个
g
M = cor(t(exp[g,])) # t(exp[g,])是转置，行变成列，然后cor()计算列与列之间的相关性
pheatmap(M)
library(paletteer)#配色R包
my_color = rev(paletteer_d("RColorBrewer::RdYlBu")) # paletteer_d（）是包里的颜色，rev()就逆转了包里颜色的顺序
my_color = colorRampPalette(my_color)(10) #把这一组颜色切分成10中颜色
corrplot(M, type="upper", #画的cowplot是不能赋值的
method="pie",
order="hclust",
col=my_color,
tl.col="black",
tl.srt=45)
library(cowplot)
cor_plot <- recordPlot() #只有当画图框里有图才能被记录拼图
代码语言：javascript复制load("pca_plot.Rdata")
plot_grid(pca_plot,cor_plot,
volcano_plot,heatmap_plot$gtable)
dev.off()保存
代码语言：javascript复制pdf("deg.pdf")
plot_grid(pca_plot,cor_plot,
volcano_plot,heatmap_plot$gtable)
dev.off()十三、富集分析
提前下载的包
代码语言：javascript复制load(file = 'step4output.Rdata')
library(clusterProfiler)
library(ggthemes)
library(org.Hs.eg.db)
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(stringr)
library(enrichplot)1.输入数据
代码语言：javascript复制gene_up = deg$ENTREZID[deg$change == 'up']
gene_down = deg$ENTREZID[deg$change == 'down']
gene_diff = c(gene_up,gene_down)#合并上调基因和下调基因2.富集
以下步骤耗时很长，设置了存在即跳过
代码语言：javascript复制f = paste0(gse_number,"_GO.Rdata");f
if(!file.exists(f)){
ego <- enrichGO(gene = gene_diff,
OrgDb= org.Hs.eg.db,#物种来源
ont = "ALL",
readable = TRUE)#entrezid又变成sample，具有可读性
ego_BP <- enrichGO(gene = gene_diff,
OrgDb= org.Hs.eg.db,
ont = "BP",
readable = TRUE)
#ont参数：One of "BP", "MF", and "CC" subontologies, or "ALL" for all three.
save(ego,ego_BP,file = f)
}
load(f)3.可视化
条带图
代码语言：javascript复制barplot(ego)
barplot(ego, split = "ONTOLOGY", font.size = 10,
showCategory = 5)
facet_grid(ONTOLOGY ~ ., space = "free_y",scales = "free_y") 气泡图
代码语言：javascript复制dotplot(ego)
dotplot(ego, split = "ONTOLOGY", font.size = 10,
showCategory = 5)
facet_grid(ONTOLOGY ~ ., space = "free_y",scales = "free_y") 4.展示top通路的共同基因，要放大看
代码语言：javascript复制#gl 用于设置下图的颜色
gl = deg$logFC
names(gl)=deg$ENTREZID
#Gene-Concept Network,要放大看
cnetplot(ego,
#layout = "star",
color.params = list(foldChange = gl),
showCategory = 3)十四、KEGG pathway analysis
上调、下调、差异、所有基因
1.输入数据
代码语言：javascript复制gene_up = deg[deg$change == 'up','ENTREZID']
gene_down = deg[deg$change == 'down','ENTREZID']
gene_diff = c(gene_up,gene_down)2.对上调/下调/所有差异基因进行富集分析
代码语言：javascript复制f2 = paste0(gse_number,"_KEGG.Rdata")
if(!file.exists(f2)){
kk.up <- enrichKEGG(gene = gene_up,
organism = 'hsa')
kk.down <- enrichKEGG(gene = gene_down,
organism = 'hsa')
kk.diff <- enrichKEGG(gene = gene_diff,
organism = 'hsa')
save(kk.diff,kk.down,kk.up,file = f2)
}
load(f2)3.看看富集到了吗？
https://mp.weixin.qq.com/s/NglawJgVgrMJ0QfD-YRBQg
代码语言：javascript复制table(kk.diff@result$p.adjust<0.05)
table(kk.up@result$p.adjust<0.05)
table(kk.down@result$p.adjust<0.05)
#实验数据在KEGG中没有富集到很正常，因为KEGG的数据库本来就很小。4.双向图
富集分析所有图表默认都是用p.adjust,富集不到可以退而求其次用p值，在文中说明即可
代码语言：javascript复制source("kegg_plot_function.R")#在不打开该文件的前提下全选运行
g_kegg <- kegg_plot(kk.up,kk.down)
g_kegg
