一、纳米孔测序在宏基因组中的应用
基于鸟枪法（Shotgun Sequencing）的高通量测序已经走过 10 多年，在宏基因组领域的应用也超过 10 年，在这 10 多年里，基于二代测序高通量的特性，在宏基因组，16S 测序中已经取得了非常大的进展。然而，二代测序读长短、建库周期长、无法实时测序等技术特点，依然限制了宏基因组数据分析的发展。尤其是读长短，只有不到 2X300bp，比对唯一性差，会造成一对多的比对，并且短读长无法得到好的拼接效果，无法直接从宏基因组中拼接出完整细菌基因组等。而这些技术缺点，通过新一代的纳米孔测序可以很好的解决，纳米孔诸多的优点为宏基因组研究带来了新的突破，下面我们来总结一下 nanopore 测序技术在宏基因组中的应用。
1、在采样点直接测序分析
2、病原微生物快速鉴定
3、耐药基因识别
4、长读长具有更高的准确性
5、基因组中拼接细菌完成图
二、Centrifuge 软件配置
2.1 centrifuge 简介
Centrifuge 是一款快速有效的宏基因组物种组成分类的软件，采用了结合 BWT 变换（Burrows-Wheeler transform，BWT）和 FM 索引（Ferragina-Manzini ，FM）的策略对序列分类进行优化，通过基因组压缩策略有效降低了内存的需求，因此可以处理 NT 库级别的库索引。Centrifuge 为 Johns Hopkins University CCB（The Center for Computational Biology）出品， 采用的软件架构和 bowtie2、hisat2 等还是比较类似，命令行接口也类似，学习成本比较低。Centrifuge 目前是纳米孔官方分析平台 EPI2ME 中 WIMP 模块采用的软件。
Centrifuge 允许一条序列可以有多个 taxonomy 标签，并允许通过设置阈值将多个 hits 回归到 LCA 模式，针对 multi-hit 模式，通过 EM 算法可以进行丰度定量。centrifuge-kreport 提供了将 Centrifuge 的结果转换成 Kraken 风格的结果。
官网以及github主页如下：
代码语言：javascript复制http://www.ccb.jhu.edu/software/centrifuge/
https://github.com/infphilo/centrifuge2.2 下载公共数据库索引
centrifuge 的数据库建库比较麻烦，所以可以选择一些公共数据库。Genexa 公司官方网站为我们提供了建立好的数据库。直接下载就可以使用。
h v c: 人基因组 病毒基因组 106 SARS-CoV-2 基因组，
h p v c: 人基因组 细菌基因组 病毒基因组 106 SARS-CoV-2 基因组
当前库版本 p h v（Bacteria,Viruses, Human），大小 13G， 包含了 28718 条核酸序列，14871 个 NCBI Taxonomy 节点，8382 species ， NT 库 77G 大小， 包含了 39648092 条核酸序列，1028487 个物种信息。
下载已有数据
h v c: 人基因组 病毒基因组 106 SARS-CoV-2 基因组
代码语言：javascript复制https://zenodo.org/record/3732127/files/h v c.tar.gz?download=1h p v c: 人基因组 细菌基因组 病毒基因组 106 SARS-CoV-2 基因组
代码语言：javascript复制https://zenodo.org/record/3732127/files/h p v c.tar.gz?download=12.3 建立自己的索引
1、NCBI refseq 数据库
如果想要自行建库也可以，首先下载 NCBI ref 数据库，例如全部细菌基因组，古细菌基因组以及病毒基因组，以及物种分类数据库 taxonomy，如果要比对宿主，也可以添加人或者小鼠全基因组。友情提示：网速一定要好，否则很难成功。
代码语言：javascript复制#下载 ncbi 数据库
./centrifuge-download -o taxonomy taxonomy
#下载 refseq 细菌（17927），古细菌（366）以及病毒基因组（）
centrifuge-download -o library -m -d "archaea,bacteria,viral" refseq > seqid2taxid.map
#加入人以及小鼠基因组
centrifuge-download -o library -d "vertebrate_mammalian" -a "Chromosome" -t 9606,10090 -c 'reference genome' >> seqid2taxid.map
#合并数据
cat library/*/*.fna > input-sequences.fna
#建立索引
centrifuge-build -p 4 --conversion-table seqid2taxid.map --taxonomy-tree taxonomy/nodes.dmp --name-table taxonomy/names.dmp input-sequences.fna abv2、使用 nt 库索引
nt 库包含全部测序序列，内容比较全，但是缺点是数据量太大，无论是建立索引还是比对都比较耗时。
代码语言：javascript复制#nt库创建索引
zcat nucl_gb.accession2taxid.gz | awk '{print $2"t"$3}' >acc_to_tid.dmp
python2 /ifs1/Software/biosoft/centrifuge/centrifuge-build --conversion-table acc_to_tid.dmp --taxonomy-tree nodes.dmp --name-table names.dmp nt nt写在最后：有时间我们会努力更新的。大家互动交流可以前去论坛，地址在下面，复制去浏览器即可访问，弥补下公众号没有留言功能的缺憾。
代码语言：javascript复制bioinfoer.com有些板块也可以预设为大家日常趣事的分享等，欢迎大家来提建议。
