双特异性抗体在急性髓细胞白血病治疗中的应用

上一期我们以罗氏的明星双特异性抗体RG7828(mosunetuzumab)为例，介绍了它应用于治疗血液系统中B细胞来源的恶性肿瘤的潜力。今天的这篇综述则概括了目前双特异性抗体在急性髓细胞白血病治疗中的应用。我们一起学习一下

前言

双特异性抗体由两种或多种抗体的抗原识别片段组成，使其可以同时与靶向细胞以及免疫效应细胞结合。早在20世纪80年代，科学家们就对免疫效应细胞靶向特定癌症相关抗原的能力以及其在癌症治疗方面的应用前景表现出了浓厚兴趣。近来迅猛发展的医疗技术使得重组蛋白类生物制品的工程设计，开发和生产变得更加容易，再加上制药行业的需求，极大地推动了双特异性抗体的研究。今天，已经有超过50种不同类型的双特异性抗体正在进行临床试验。众多双特异性抗体技术平台正在接受检验，其中包括单链可变片段(single-chain variable fragment, scFv)，串联双抗体(tandem diabodies, TandAb)，双特异性T细胞桥接抗体(bispecific T-cell engagers, BiTE)，双亲和力重新定向抗体(dual affinity retargeting antibodies, DART)和双特异性杀伤细胞桥接抗体(Bispecific killer cell engagers, BiKEs) (图1)。在癌症治疗中，目前正在开发的双特异性抗体要么能够募集并重定向免疫效应细胞来杀伤肿瘤细胞或通过阻断肿瘤表面配体与受体的结合来抑制不同的肿瘤相关信号通路。目前最常用的策略是，在双特异性抗体上设计一个片段与肿瘤细胞上的抗原结合，而另一个片段能够与免疫效应细胞结合(经常是通过结合CD3分子来连接T细胞)。这就使得双特异性抗体能够重定向免疫效应细胞到肿瘤细胞周围并且不依赖于主要组织相容性复合体（MHC），从而可以避免因为肿瘤细胞下调MHC而导致的免疫逃逸(图2)。取决于双特异性抗体重定向的效应免疫细胞的类型，靶细胞，也就是肿瘤细胞，通常被颗粒酶B/穿孔素介导的或者是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)杀死。

与抗体药物偶联物和传统单克隆抗体相比，双特异性抗体具有几个明显的优势。首先，双特异性抗体有可能被设计用来募集各种免疫效应细胞，包括T细胞、自然杀伤细胞(NKs)或免疫调节类蛋白，比如CD47或PD-1。另外，相比于抗体药物偶联物的疗效依赖于靶抗原的内吞，双特异性抗体不依赖于此过程来发挥其治疗作用，因此可以有更广阔的肿瘤抗原选择空间。Blinatumomab，一种靶向CD19和CD3的双特异性抗体，已经成为美国食品和药物管理局（FDA）批准的首个治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病的双特异性抗体。鉴于blinatumomab取得的成功，业界在研究并开发双特异性抗体来治疗急性髓细胞性白血病(AML)中做出了巨大努力。

双特异抗体的构建

最初，双特异性抗体的构建存在诸如宿主小鼠产生抗双特异性抗体的中和抗体、复杂的纯化步骤、产率低等问题。但随着抗体工程技术的进步，我们已经有能力生产出有效的双特异性抗体，不仅具有募集不同免疫效应细胞的能力，而且具有出色的组织渗透性，易于生产且具有更长的半衰期。双特异性T细胞桥接抗体(BiTE)由两个被一根多肽接头串联起来的单链可变片段（scFv）组成（图1）。由此带来的问题是它的低分子量（BiTE的分子量约为55KDa），这意味着这种双特异性抗体会轻易的被肾脏清除。除此之外，标准的BiTE缺少普通抗体的Fc片段（图1）。由于不存在Fc介导的，延长免疫球蛋白G（IgG）的血清半衰期的新生儿Fc受体循环机制，以及BiTE的分子量很小的原因，它的半衰期短到只有1-4小时。因此，这类生物制品通常需要通过连续静脉注射的方式给药。同样的，由于缺少Fc片段，BiTE也不能介导ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity），CDC（complement-dependent cytotoxicity）以及ADCP（antibody-dependent cellular phagocytosis）来杀伤肿瘤细胞。

除了串联的scFv构型，Diabody类的构型也是BiTE常用的构型。Diabody由两个共价结合的抗体片段的二聚体组成。DART是diabody的一种形式，由两条多肽链分别连接了一个轻链可变区片段（light-chain variable segment, VL）和一个重链可变区片段（heavy-chain variable segment,VH）（图1）。轻重链之间由二硫键共价连接，保证了抗体的稳定性。其他Diabody类的构型还包括TandAb（图1）。这种构型对于每个抗原有两个结合片段，因此提高了二价抗体的亲和力，而且由于分子量超过了肾脏清除的阈值，因此与分子量较低的抗体构型相比，它的半衰期更长。

双特异性杀伤细胞桥接抗体(Bispecific killer cell engagers, BiKEs)和三特异性杀伤细胞桥接抗体(tri-specific killer cell engagers, TriKEs）利用NK细胞靶向肿瘤细胞。BiKE构型与BiTE几乎相同，区别是BiKE靶向的是NK细胞上的CD16而不是T细胞上的CD3。TriKE也具有与BiKE类似的构型。区别是TriKE还拥有另一个结合片段，例如白介素15，来刺激NK细胞的增殖。

其它基于IgG构型的全长双特异性抗体得益于Fc片段带来的相关效应以及接近于天然抗体的半衰期，可能在某些方面比上文介绍的片段化的双特异性抗体有优势。目前，至少有12种双特异性抗体正在进行治疗AML的临床试验。

开发用于AML治疗的双特异性抗体面临的挑战

缺乏合适的肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAA）一直是开发治疗AML的抗体药物的限制因素。理想的靶抗原应该是在AML细胞（包括白血病干细胞）上广泛表达，而在正常造血细胞和其它非造血细胞上不表达。同时，理想的靶抗原不能在被抗体结合后表达下调，而且要对白血病细胞的生存至关重要生存。在急性淋巴细胞白血病（ALL）中，基于CD19广泛表达于B细胞上，双特异性抗体blinatumomab选择了CD19作为靶点。因此，运用blinatumomab治疗AML的主要毒副作用是低丙球蛋白血症和淋巴细胞减少症，但这些通常是可控的。同样的，在AML中，正常造血细胞和白血病细胞的抗原表达谱高度重叠。这种重叠导致了抗体靶向治疗对骨髓产生脱靶毒性（off-target toxicity），进而引起长期的血细胞减少症，特别是严重的中性粒细胞减少症，最终可能危及患者生命。目前，CD33和CD123已成为AML中对骨髓副作用最小的常用靶点。

细胞因子释放综合征（Cytokine release syndrome, CRS）是一种由于免疫效应细胞激活引起细胞因子的过度释放导致的全身性炎症反应。CRS是双特异性抗体疗法引起的常见的毒性反应，它与炎症细胞因子的水平相关，例如铁蛋白，C反应蛋白，白介素6，白介素2，干扰素γ和肿瘤坏死因子。CRS可以表现出多种临床表现，包括流感症状、发烧、血管扩张性休克和器官功能性障碍，比如急性呼吸窘迫综合征，肾脏、肝脏、和心脏衰竭。另外，神经毒性在双特异性抗体治疗中也很常见，可以表现为头痛、唤词困难、癫痫、谵妄、失语和脑水肿。CRS发生的频率和严重程度受到肿瘤负荷、抗体构型、靶点选择和抗体剂量等多方面因素影响。CRS的临床处理包括暂停使用抗体药，使用退热药和皮质类固醇，以及在严重情况下使用升压药和抗白介素治疗（例如托珠单抗和西妥昔单抗）。

AML中双特异性抗体的靶点

CD33

CD33是一种67-kD大小的糖蛋白跨膜细胞表面受体，在造血干细胞向髓系细胞的分化过程中开始出现；并在髓样祖细胞，髓样树突细胞，单核细胞上表达，但在粒细胞和巨噬细胞上少见。尽管CD33主要表达于髓系细胞上，但已有研究发现CD33也在一些淋巴样细胞上低水平表达，例如活化的T细胞和NK细胞。CD33在正常的造血干中不表达或以低水平表达，但在造血系统之外不表达。CD33在超过90%的患者AML细胞和白血病干细胞上呈阳性。目前，至少有六个不同的针对CD33的双特异性抗体正在进行临床试验以评估其在AML患者中的安全性和有效性（表1）。

第一个靶向CD33的BiTE是AMG330。它可以激活并促进AML患者临床样本中的T细胞的增殖，并且以剂量依赖性方式促使正常骨髓细胞和AML细胞的体外裂解。AMG330不会改变CD33在细胞表面的表达丰度并且不会被细胞内吞。临床前数据表明，AMG330（在存在激活的人源T细胞的情况下）可以通过抑制皮下AML细胞系异种移植瘤的增殖来提高小鼠的存活率。AMG330目前正在进行I期临床研究（NCT02520427），剂量最高达到720μg/天（延长连续输注）。初步数据证明，该药物具有良好的耐受性、安全性以及抗白血病的活性，为后续进行的进一步剂量爬坡试验提供了有力的证据。AMG673是相对新型的，进行了半衰期延长改造的抗CD33和CD3 的BiTE。由于AMG673融合了Fc片段，导致该抗体的半衰期延长为1周，因此它的给药方式是以两周为周期，每周进行一次短时间、间歇性的静脉注射。初步临床数据显示，AMG673在最高剂量为每剂72毫克时并没有出现不可接受的毒性作用。目前，该药正在复发/难治性AML患者中进行进一步的剂量爬坡试验（NCT03224819）。

AMV564是一个抗CD33和CD3的tandAb（表1），旨在以增加分子量的形式最小化肾脏对其的清除率。除了可以重定向T细胞至白血病细胞，AMG574还可以耗竭髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs），后者可以抑制正常T细胞的功能。因此，它也许可以降低患者对免疫疗法产生反应的阈值。AMV564目前正在进行一项3 3设计的I期剂量递增试验，在28天的周期中连续14天进行静脉输注（NCT03144245）。初步数据显示，AMV564在某些患者中具有良好的安全性和耐受性并观察到临床响应 [29]。GTB-3550是一种主要用于治疗AML的TriKE。它是一种三特异性scFv重组抗体，由抗CD33和抗CD16抗体的轻链和重链的可变区和IL-15组成（图2），目前正在进行临床一期剂量递增试验（NCT03214666）。

CD33的胞外区由一个氨基末端的C2-set 免疫球蛋白结构域（第3、4外显子）和一个V-set免疫球蛋白结构域（第2外显子）组成。CD33的RNA通过可变剪接可以产生较短的同工型，其保留C2-set免疫球蛋白结构域，但缺少V-set结构域。最近的研究表明，大约有50％的欧洲和美洲的AML患者由于单核苷酸多态性（rs12459419）的原因缺少CD33的V-set结构域。在几种靶向CD33 V结构域的单克隆抗体的临床研究中，它们对具有rs12459419单核苷酸多态性的AML患者作用非常有限。基于这些数据，强生正在开发一种识别CD33 C2结构域的新型双特异性抗体JNJ-67571244，目前正在进行早期临床试验（NCT03915379）。

CD123

CD123（IL-3受体α链）是在髓样祖细胞、单核细胞、浆细胞样树突细胞和嗜碱性粒细胞上表达的IL-3受体的低亲和力结合片段。它对抗凋亡蛋白的上调和分化，造血干细胞的增殖起关键作用。CD123通常在AML中过表达并且与预后差相关。在临床前的研究中，用抗CD123的抗体能够显著延长异种移植小鼠模型的生存期。目前，多项评估靶向CD123的双特异性抗体的安全性和临床疗效的临床试验正在进行中（表1）。

伏妥珠单抗(Flotetuzumab)，一种抗CD123和CD3双特异性DART，它是最早被用于治疗AML患者的抗体之一。给药方式是以28天为一周期，第一周期中每周7天静脉输注，持续4周；之后的周期按照给药4天/停3天的方案进行。在最近的一份报告中，28例原发性难治性AML患者接受了500 ng/kg/天的伏妥珠单抗静脉输注治疗（推荐的II期剂量），其中有9例（32％）完全缓解，患者3级CRS的发生率为3％。目前，该研究已经在进一步招募受试者，以寻找合适的生物学和临床生物标志物，帮助确定最可能对伏妥珠单抗响应的AML患者（NCT02152956）。

JNJ-63709178是抗CD123和CD3的双特异性IgG1全长抗体，也称为Genmab DuoBody。在体外实验中，该抗体能够将T细胞募集到表达CD123的癌细胞周围并诱导细胞毒性作用。一项用该抗体治疗复发/难治性AML的I期临床试验于2016年开始，目前仍在招募受试者（NCT02715011）。但到目前为止，尚未有临床数据披露。XmAb14045是另一种包含Fc片段的全长靶向CD123和CD3的双特异性抗体，使其延长了半衰期并可以间歇给药。在一项临床I期的剂量递增研究中，在13例高剂量组复发/难治性AML患者中（截至报告日期），观察到3例（23％）完全缓解。安全性方面，CRS是最常见的副反应，其中11%的受试者发生了3级CRS。该研究已经继续招募受试者，来进一步测试优化后给药剂量（NCT02730312）。

APVO436是一种新型双特异性抗体（CD123/CD3），其中包含修饰过的Fc片段（ADAPTIR构型），可延长半衰期，但不会通过Fc受体结合靶细胞或T细胞。除了延长半衰期外，ADAPTIR构型的双特异性抗体在临床前动物研究中显示其可以减少细胞因子的释放。最近，一项旨在评估该抗体安全性和有效性的I期临床试验已经启动（NCT03647800）。

CLEC12A

CLEC12A（也称为CLL-1）是在白血病干细胞上特异性表达但在造血干细胞和早期祖细胞上不表达的髓系分化抗原。MCLA-117，一种靶向CLEC12A和CD3的全长IgG1双特异性抗体，被认为是治疗AML的候选药物。对正常骨髓分析后表明，该抗体能够结合粒系-单核系造血祖细胞，但不会损害CD34 /CD38-的造血干细胞。临床前研究表明，该抗体促进了抗原依赖性T细胞活化和T细胞介导的AML细胞裂解。目前，一项临床试验（NCT03038230）正在评估MCLA-117在治疗复发/难治性AML患者中作用。

FLT3 (CD135)

FMS相关酪氨酸激酶3（FLT3）受体通常在AML细胞和白血病干细胞上表达。在正常骨髓中，由于FLT3的表达仅限于造血干细胞的一个亚群，因此它被认为是有潜力的双特异性抗体靶点。AMG427，一种针对FLT3和CD3的BiTE抗体，目前正在AML患者中进行临床试验（NCT03541369）。

结论

利用先天免疫系统中的效应功能来治疗AML具有巨大的潜力，它在其他血液系统恶性肿瘤的治疗中已经初见曙光。凭借先进的重组抗体技术，许多具有不同作用机制的双特异性抗体不断出现，尽管它们都有自身的优势和局限性。除了募集并重定向T细胞的方法，募集NK细胞的新型抗体（例如BiKE和TriKEs）扩展了利用免疫细胞的思路。另外，我们在未来应该更深入的研究药代动力学和给药方式，以最大程度地减少药物给患者带来的毒性，并最大限度的提高药物响应率。随着越来越多的抗体被工程化来减少细胞因子的释放并改善其半衰期，治疗带来的毒副反应和住院可能会因此减少。耐药性仍然是严峻的挑战，尤其是在具有高肿瘤负担的难治性AML中。使用双特异性抗体联合常规方案或其他形式的免疫疗法的组合疗法可能进一步提高这些药物的临床疗效。

总结

目前，至少有11种双特异性抗体临床试验正在进行中，以治疗AML患者；

早期临床数据显示，一些双特异性抗体已经展现出令人鼓舞的安全性和有效性；

除了募集T细胞的方法外，新构型的抗体，例如双特异性杀伤细胞桥接抗体和三特异性杀伤细胞桥接抗体利用NK细胞扩展了利用免疫细胞杀伤肿瘤细胞的思路。

展望

缺乏合适的肿瘤相关抗原（tumor-associated antigens, TAA）一直是开发治疗AML的抗体药物的限制因素；

双特异性抗体通过结合细胞表面受体来发挥治疗作用，而不依赖于受体内吞作用，因此可以有更广阔的肿瘤抗原选择空间；

未来应该更深入的研究药代动力学和给药方式，以最大程度地减少药物给患者带来的毒性，并最大限度的提高药物响应率。