2022年5月5日，Astex Pharmaceuticals的科学家们在J Med Chem杂志上对静电势计算在药物设计中的应用进行了综述，并且利用6个具体的例子阐明了ESP计算对于基于结构的药物设计的改善和指导意义。还推荐了该公司研发的一款基于AI的快速ESP计算工具：GC-DNN，该工具在精度上可以媲美DFT方法计算的ESP结果。
在基于结构的药物发现中，优化静电互补是提高分子对特定蛋白靶点亲和力的重要策略。本篇综述概述了静电互补优化策略在药物设计中的运用，并且列举了一些相关案例，包括蛋白质-配体静电互补或分子内静电作用的优化提高了靶标亲和力 (最高可达250倍)、理化性质、体外性质和脱靶选择性。本文还回顾了一系列FXa因子抑制剂，它们显示了近8000倍的亲和力变化范围，且与计算的静电势 (ESP) 表面相关联。最近，利用图卷积深度神经网络快速生成高质量ESP表面的发展，有可能使这个有用的工具药物化学领域得到更广泛的认可。
静电相互作用在分子识别中起关键作用，其表征和调控是基于结构的药物设计 (SBDD) 的核心内容。在SBDD中，最大化配体与蛋白质之间的形状和静电互补性是提高结合亲和力和选择性的有效策略。然而，静电互补是一个比形状互补更复杂的概念。
就算训练有素的药物化学家和计算化学家也不容易评估静电作用的能量和择优取向性，而且去溶剂化的罚分还使得这项任务更加复杂。
静电势 (ESP) 表面的计算可以帮助识别静电匹配或失配的区域，从而便于比较含有不同取代基或核心支架的多个配体。例如，芳香族化合物中取代基对ESP的影响已被广泛研究，并被归结为π-共振、σ-诱导和静电场效应，仅受芳香族化合物π-体系整体电子密度变化的微小影响。ESP表面的使用考虑了这些因素，提供了快速理解蛋白质-配体互补的方法。
本文描述了一些SBDD案例研究，其中ESP分析和后续修饰被用来优化蛋白质-配体静电互补，以提高亲和力和选择性。随后，本文还讨论了ESP方法如何应用于调节分子内相互作用以稳定配体的生物活性构象。
1 静电势ESP的计算
通过对分子ESP表面的可视化和分析，分子静电学研究得以被广泛研究。分子表面任意一点的ESP能量是分子电荷分布与位于该表面点的单位正电荷相互作用的能量值。量子力学 (QM) 从头算方法可以最精确地计算ESP，这种技术由于对更复杂的分子需要较高的计算时间，因而大多局限于小分子。例如，图1B展示了用从头计算的密度泛函理论 (DFT) 方法计算氯苯的ESP表面。此外，一些研究还建立了连续溶剂模型，并将其应用于QM方法，模拟了溶剂对静电作用的影响。为了提高计算速度，可以参数化以原子为中心的电荷来重现QM方法得到的ESP表面。分子力学力场中，电荷用来计算ESP表面。例如，图1C显示了用AM1-BCC原子中心电荷生成氯苯的ESP表面。这种使用原子电荷的方法可以快速计算包括蛋白质和DNA在内的大分子的ESP，因为根据预定的原子类型可以对不同物质使用相同的原子电荷。为了模拟具有原子中心电荷的连续溶剂，人们发展了快速求解泊松玻尔兹曼方程的方法，并在微管和核糖体等复杂大分子上得到了应用。
虽然利用原子电荷可以更快速地计算ESP表面，但与QM方法导出的表面相比，它们的精度较低，如图1C中的均方根误差值 (RMSEv) 所示。使用原子电荷的一个主要限制是没有诸如σ孔、π轨道和孤对电子等特征，这些特征要么合并在原子中心上，要么在参数化过程中没有考虑。
图1D所示为氯苯的π轨道和σ-hole作为离原子中心特征点 (用与碳、氯原子相连的较小球体表示)。一些力场，如XED，明确地将这些离原子位置作为额外的电荷中心，以提高精确度，更好地描述涉及电子各向异性的系统。用XED力场计算的ESP被用来开发SBDD工具来估计蛋白质-配体复合物的静电互补性。
图1. 各种方法计算的ESP表面
另外一个主要的限制，尤其是运用于小分子的时候，由于在电荷参数化过程中使用的分子数目有限，原子电荷的往往分配不正确。在许多实际应用中，QM方法可以用来获得小分子的ESP，而原子电荷可以用于蛋白质。然而，由于计算时间成本较高，QM方法仍然存在交互药物设计应用的瓶颈，对于分子量为400的典型类药物分子，计算QM的ESP大约需要30分钟。
为了克服经验模型计算电荷时存在的问题，人们发展了各种机器/深度学习方法来构建电荷预测模型；这些可用于分子力学计算和分子动力学模拟。当附加特征如σ-hole、π轨道和孤对作为离原子位 (off-atom sites) 和电荷导出 (用最小二乘法拟合) 来重现量化的ESP表面时，计算得到的ESP表面与从头计算的ESP表面 (图 1B , D) 非常相似。
最近，Rathi等人利用对超过10万个分子的QM计算的ESPs进行拟合得到的原子和非原子位点电荷来训练和验证图卷积深度神经网络 (GC-DNN) 模型。对于图1C，E中的氯苯，这种差异得到了例证。此外，作者还实现了一个经验模型，该模型缩小了形式电荷分子中带电原子的部分电荷，进一步改进了预测ESP表面的可视化。虽然这种尺度限制了未带电分子和带正电荷分子的ESP之间的直接比较，但它仍然允许在一系列带正式电荷分子内进行相对比较，以帮助SBDD中优化蛋白质-配体相互作用。总体而言，该模型能够在适合于交互式SBDD的时间尺度上计算高精度的配体和蛋白质ESP表面 (对于分子量为400的典型药物分子，计算GC-DNN ESP需要约0.3s)，该模型目前正在被Astex的药物化学家使用。
2 蛋白质-配体静电互补性的优化
案例1：组织蛋白酶S (CatS)和组织蛋白酶L (CatL)的双重抑制
Stahl等人报告了一个使用蛋白质ESPs开发双重CatS 和CatL抑制剂的例子，他们以Roche发现的一系列CatS/CatL抑制剂作为出发点。对两种蛋白的ESP表面分析发现，CatL结合位点的表面电位主要为负值，含有6个酸性的天冬氨酸和谷氨酸，在结合位点7Å范围内没有碱性残基赖氨酸和精氨酸，而CatS结合位点相同范围内存在一个天冬氨酸和赖氨酸，如图2所示。
图2. CatL和CatL的静电势（ESP）表面以及抑制剂结合模式
为了提高与CatL的静电互补性，将化合物1中的环丙基连接体之一置换为碱性氮杂环丁烷基团 (图2)。这导致CatL结合亲和力提高了11倍，而对CatS的亲和力只降低了2倍。化合物2在组织蛋白酶K (CatK)上也保持了良好的选择性窗口。化合物2与CatL结合的晶体结构 (图2c) 表明，氮杂环丁烷与酸性残基没有直接作用，但由于静电作用的长程性，有利于亲和力的提高。对5-氯吡啶的进一步优化是基于之前报道的在CatL的S3口袋中卤键的探索得到的化合物3，它是CatL和CatS的一个单位数纳摩尔级别的抑制剂，保持了CatK的选择性 (图3)。
图3. CatL抑制剂1的优化到CatL/CatS双重抑制剂3的发现。
案例2：FXa抑制剂
2008年GSK公开了一系列FXa抑制剂的优化策略。与FXa络合的先导化合物4的X晶体衍射结构表明，芳基砜结合在S4口袋中，与Trp215形成边对面的芳香相互作用。芳基砜上的邻位氢与Trp215的富电子吲哚接近 (图4中的黄色椭圆形)，因此作者假设这种相互作用和抑制剂的亲和力可以通过取代基在另一个邻位上的σ电子吸出作用来调节，也就是化合物4上的二甲砜。
图4. FXa抑制剂和蛋白静电势表面
在寻求优化S4口袋相互作用的同时，也有降低化合物亲油性的愿望，因此将化合物4中的正氟苯基替换为吡啶，在末端芳环的正位上安装一系列取代基，得到如表1中的一系列化合物。测定了这些化合物的亲和力，并绘制了哈米特σm系数 (图5A)，证实了哈米特系数与FXa的亲和力有明显的关系。计算的趋势线表明，基于哈米特系数，可以预测一个前瞻性化合物的亲和力 (pKi = 5.28σm 6.39)；这种方法的R2值达到了0.897。
图5. 化合物哈米特系数σm与活性值pKi相关性
表1. 化合物5-15靶向FXa亲和力统计
虽然这里所述的优化工作需要对所列出的所有化合物进行合成，但可以利用ESP计算来预测最有潜力的分子，从而减少需要合成的化合物数量。为了说明这一点，我们利用GC-DNN ESP模型 (图6中的化合物5、12、15)，计算了双芳基S4口袋模体的ESP表面，发现邻位氢上的电荷 (Vh) 可以用来正确地排序化合物的亲和力 (图5B ; R2 = 0.757)。这个例子说明了ESP计算在建立初始SAR的情况下准确预测化合物亲和力的能力，类似的方法可以应用于多种靶向蛋白。
图6.化合物ESP表面计算显示结果
案例3：凋亡蛋白抑制剂
2015年，美国Astex公司的科学家报道了针对细胞凋亡抑制蛋白1和2 (c IAP1/2) 和X连锁凋亡抑制蛋白 (X IAP) 的片段的发现和优化。利用SBDD和一个小而集中的化合物库，将吡咯烷化合物17优化为吲哚啉化合物18 (图7)。
图7. 片段16-18的优化路线
虽然这种改变只在亲和力上略有提高，但X射线晶体结构显示了与蛋白质表面良好的形状互补性，并有望将载体插入相邻的子口袋中，需要进一步优化。为了提高化合物18的结合亲和力，考察了结合位点的静电环境 (图8)。ESP图谱显示近端蛋白表面由于一个骨架羰基和Tyr324的酚氧作用而出现负电荷斑。X射线晶体结构表明，吲哚啉的芳香部分堆积在这个负电荷区域的顶部。
图8. 化合物18以及XIAP蛋白ESP表面
作者假设化合物18对靶分子的弱亲和力是由于吲哚啉负电性π电子云与蛋白质负电性表面的静电排斥作用造成的。为了验证这一假设，合成了18个具有不同电负性的类似物，并在吲哚啉的C-6位上根据哈米特σm系数选择添加给电子或吸电子取代基，如表2所示。
表2. 不同取代的吲哚啉环化合物亲和力和哈米特σm系数
图9A显示，XIAP-BIR3的结合亲和力对吲哚啉π-体系的电子性质非常敏感：缺电子的吲哚啉 (26和27) 比富电子的吲哚啉 (19和20) 强约2个数量级。在相关蛋白cIAP1中，Tyr324被一个苯丙氨酸取代，这导致XIAP中出现的电负斑减少，当测定18-27与cIAP1的亲和力时 (表2)，亲和力与哈米特σm系数无相关性 (图9B)。证实了吲哚啉环与蛋白质表面的静电互补作用的优化是XIAP亲和力提高的原因。
图9，化合物亲和力与哈米特σm系数相关性
为了进一步耗散吲哚啉环的正电性，采用从头算方法计算了预期氮茚目标化合物28的ESP表面，并与吲哚啉化合物19的ESP表面进行了比较 (图10)。此分析显示芳环的正电性明显降低。化合物28的合成表明，与19相比，化合物28对XIAP-BIR3的亲和力 (7.7μM) 提高了约50倍，同时也为进一步阐述这些化合物提供了有用的合成手柄。
图10. 化合物19和28的静电势面的比较显示
案例4：着丝粒相关蛋白E (CENP-E)
本案例中，蛋白质-配体复合物的X射线晶体结构被用来可视化ESP表面；但是Hirayama和他的Takeda同事已经发表了一个关于CENP-E抑制剂优化的例子，其中一个基于纺锤体驱动蛋白 (KSP) 运动结构域的同源模型被用来生成ESP数据。从高通量虚拟筛选鉴定出的噻吩并吡啶酮化合物29出发，对酰胺进行了优化，得到了亲和力显著提高的化合物30 (图11)。对同源模型中的化合物29分析表明，吡啶酮羰基没有与蛋白质发生任何相互作用；这使得作者重新设计核心支架，在生化实验中得到了32 nM抑制的噻吩吡咯化合物31。
图11. 化合物29的优化
为了更好地理解噻吩[3,2-b]吡咯C-3位取代时看到的SAR，计算了一系列类似物的ESP表面 (图13)。为了简化计算，酰胺被简单的二甲胺取代。亲和抑制剂，如含有3 - Br (化合物32)或3 - Cl (化合物33) 的抑制剂，在噻吩环上显示出中性静电势 (图12)。相比之下，3 -甲基衍生物化合物34表现为负的ESP，3 -腈类似物35在噻吩环上表现为正的ESP。同源模型认为该骨架处于一个含有异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸残基的疏水口袋内；因此，作者假设CENP-E需要一个中性的骨架来结合，生化实验数据证实了这一点。
图12. 基于ESP的化合物31的优化
化合物31表现出良好的生化亲和力，但是具有较差的细胞活性 (p-HHE EC50 = 3.0μM)。为了提高细胞活性，作者尝试从噻吩吡咯中进行第二个骨架跃迁。在前面ESP分析结果的基础上，生成了潜在骨架分子的ESP表面，由于预测溴吲哚(化合物36和38 )在噻吩环上有负的ESP，这些均未合成 (图13)。咪唑吡啶化合物40被预测具有中性ESP，因此被选择用于合成。令人欣慰的是，化合物41与31 (50nM比32nM )具有相似的生化亲和力，在PAMPA (pH7.4) 测定法 (3141 nm/s比 41353 nm/s)中，细胞亲和力 (1.54μM对比3.0μM) 提高了2倍，通透性也显著提高。尽管细胞亲和力的变化不大，但这些结果为进一步开发这种先导分子提供了信心。
图13. 基于静电势的骨架跃迁
3 分子内静电作用优化
ESP在SBDD中的应用超出了上面讨论的蛋白质-配体相互作用的优化，还包括分子内相互作用的研究。独立地分析小分子配体的静电作用可以获得关于分子内有益和有害相互作用的信息，从而使现有的SAR合理化，并为将来设计具有更高亲和力的目标分子提供机会。
在SBDD背景下，与未结合时配体的可利用构象相比，分析配体的结合或生物活性构象中的分子内相互作用具有特别重要的意义。大多数用于药物发现项目的小分子在溶液中自由时可以采用多种构象，主要由可旋转键的数目决定。优势溶液构象与观察到的结合构象之间的紧密对应有助于最小化配体结合的熵惩罚，从而在溶液中稳定生物活性构象提供了增加结合亲和力的安全策略。实验测定最低能量的配体构象通常用一维和二维 NMR谱进行，其中质子化学位移征和穿空相互作用可以用来评估配体的柔韧性程度和分配主要构象。
通过一系列方法，如官能团变化、大环化或引入分子内相互作用等，可以在溶液中实现柔性配体结构的预组织。根据经验，ESP在后一种情况下被证明是特别有用的，在这种情况下，仔细分析蛋白质-配体X射线晶体结构中观察到的分子内相互作用，可以引导在主要溶液构象中试图重现这种相互作用的合理设计。下面的例子描述了ESP驱动的优化π-π堆积作用和偶极-偶极相互作用，但该方法可以应用于其他分子内的接触，如阳离子-π、疏水或氢键相互作用。
案例5：E3泛素蛋白连接酶（MDM2）
本案例讲述了分子内ESP分析用于MDM2新型异吲哚啉酮类抑制剂的结构导向设计。早期的蛋白质-配体X射线晶体结构，如化合物42 (图14A)，呈现折叠构象，4-氯苯基和4 -乙炔基苄基取代基相互叠合。在确定了可能的分子内相互作用后，计算了化合物42的结合构象的ESP表面。这一分析暗示了两个芳香环之间存在静电排斥作用，如图14C所示，这两个π体系的ESP表面在近距离处发生红色着色。该理论得到了溶液NMR研究的支持，表明化合物42的主要构象是以开放的形式存在，两个芳香环相互远离，避免了不利的静电作用 (图14D)。
图14. 化合物42与MDM2结合的X-射线晶体结构和静电势表面
在建立了生物活性构象和溶液构象之间的差异之后，进一步的ESP计算加‘热力学循环’方法被用来模拟可能有利于结合结构中所见折叠构象的4-炔基苄基的潜在取代物 (图15)。无论是对两环间相互作用能 (Eπ-π) 的定量分析，还是对ESP表面的定性检验，都显示出对探索更多缺电子环体系的明显优势，如图15所示的氯吡啶化合物43。
图15. 化合物42的优化
令人欣慰的是，该理论被证实是由于合成的几个含有更多缺电子苄基取代基的类似物在初步的结合实验和细胞实验中都有所改善，同时亲脂性降低有助于控制理化性质。例如，与化合物42相比，化合物43在两种方法中亲和力均提高了3倍，cLogP降低了1个log单位。虽然这种亲和力的提高比上面所看到的一些例子要小，但从能量的计算差异中可以预料到。这种方法还允许将极性杂环引入到口袋中，从而使亲油配体效率 (LLE或LipE) 从2.9提高到4.4。蛋白质-配体X射线晶体学和化合物43个单独的小分子X射线结构证实生物活性折叠构象保留了更多极性芳香基团，这和ESP预测结果一致。这个例子说明了ESP识别可能发生的分子内冲突的能力，从而可以帮助合理设计新的有利于溶液相中预期相互作用的靶点，从而提高结合亲和力。
案例6：凋亡蛋白（IAP）的抑制
在进一步优化IAP拮抗剂时，可以找到分子内ESP分析的另一个例子。先前讨论的是蛋白质-配体相互作用，在本轮优化过程中注意到，几种类似物的蛋白-配体X射线结构显示了新的取代基优先采用折叠构象，填充在中心酰胺键上，例如，化合物45来自一个具有氮杂异构体核心的亚系列 (图16A)。与前面的例子一样，在确定了分子内的堆积相互作用之后，溶液核磁共振研究表明，在这种情况下，化合物45的最低自由能构象与生物活性位相一致，并观察到折叠排列 (图16B)。
图16. 化合物45与XIAP-BIR3结合的X射线晶体结构
为了更好地了解这种相互作用，并便于设计新的化合物，使观察到的堆积取向最大化，计算了哌嗪氮杂吲哚啉核的ESP表面和潜在的P2取代基 (图17)。这一分析显示，一些基团的静电分布最好地补充了核心酰胺键，增强了吸引的偶极-偶极相互作用，有利于理想的折叠结构。图17展示了两个这样的例子：芳香族和饱和杂环。
图17. 核心哌嗪-氮杂吲哚啉骨架ESP表面
氟吡唑类似物46和吡咯烷酮类化合物47的合成和测试，与母体化合物44相比，活性分别提高了2倍和5倍 (表3)，其中47在第一轮SAR探测中提供的配体效率最高 (LE = 0.29)。与上一个例子一样，这种亲和力的小幅提高伴随着LLE从3.1 (化合物44) 提高到4.3 (化合物47)，这表明这种仔细的ESP分析可以应用于改善更广泛的理化性质。与XIAP-BIR3结合的化合物47的晶体结构证实了从ESP模型预测的折叠构象的持久性，见图17。
表3. 化合物44、46、47的亲和力各异的取代
4 总结
从上面的6个例子可以看出，ESP可以用于改善和加速结构启发的药物发现计划。改善静电作用不仅可以提高化合物对蛋白质靶点的亲和力，而且如CENP-E抑制剂所示，还可以识别理化性质改善、细胞活性提高、体内轮廓潜在改善的替代骨架。FXa抑制剂的例子清楚地说明，在一个特定的系列内，需要考虑ESP特性，仔细优化可以在亲和力上获得显著增益。
这种对芳香基电子性质的优化，让人联想到Topliss提出的优化芳香基上取代基的决策树；但由于ESP可以前瞻性地计算，这将减少需要合成的化合物的数量，以达到对给定蛋白靶标最有效的取代基排列。
ESP的计算也提供了机会来识别配体和蛋白质之间的非常规相互作用，如IAP抑制剂所示。在主链羰基上堆积一个芳香环可能不是发展有利的相互作用的明显选择，但是通过了解蛋白质和配体的ESP，可以成功地优化这种相互作用。利用ESP将Cat S特异性抑制剂转变成双Cat S/Cat L抑制剂表明，通过合理地利用表面电位，可以在不明显降低对另一个靶点亲和力的情况下，优化一个靶点的亲和力。
虽然这里没有例子，但也可以设想一种情况，即ESP可以用来设计针对给定对抗靶标的选择性。在配体ESP模型 (MDM2和IAP抑制剂) 的两个例子中，我们还进行了溶液构象研究，以进一步了解分子内相互作用的性质及其对结合蛋白质能量的影响。然而，可以想见的是，即使没有这种实验信息，仅靠ESP分析仍可能有助于复合设计并给出类似结论。在MDM2拮抗剂的情况下，特别是通过ESP计算确定两个芳香环交界处的静电作用很可能需要在分子的这一位置进一步探索SAR，而随后设计更有利的类似物并不特别依赖于溶液构象的知识。
从结构信息中识别或确认不利碰撞和可取相互作用的能力，结合溶液NMR实验或其他建模技术，使得分子内ESP分析成为SBDD中一项有价值的技术。
从所讨论的例子中也可以清楚地看到，虽然优化静电互补的好处是显而易见的，但这种技术在药物化学群体中的应用是有限的。造成这种有限吸收的原因之一可能是，从历史上看，即使是对小分子而言，产生ESP也是一项相对昂贵的计算技术，需要专业的计算。这种计算开销在考虑蛋白质等大分子生成ESP的复杂性时呈指数增长。
此外，真空中计算的带正式电荷分子的ESP表面并不实际有用，这可以通过包含隐式溶剂化模型来进一步改进；但这进一步使程序复杂化，计算时间也成倍地增加。用于计算处理的图形处理单元 (GPU) 的兴起可能降低了这些计算的障碍，但它们可能仍然无法被所有配备优良设备的实验室所运用到。最近发展起来的GC-DNN模型用于生成接近DFT质量的ESP表面比传统的QM方法快许多数量级。例如，一个典型的类药分子分子量400大约需要30 min来计算DFT方法下的ESP表面。 利用最近发展的GC-DNN模型，可将计算时间缩短到0.3 s。而且通过远程电脑硬件访问，可以让那些历来无法生产QM ESP的实验室能够方便的获取ESP计算结果。我们希望，降低获取ESP数据的障碍，将起到促进药物化学中ESP表面使用增加的催化剂作用。
参考资料
Cons B D, Twigg D G, Kumar R, et al. Electrostatic Complementarity in Structure-Based Drug Design[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2022.
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