导语
T细胞构成了抗肿瘤免疫的主要组成部分。深入了解肿瘤微环境（TME）内的T细胞耗竭（TEX）异质性是克服TEX和改善临床上检查点阻断免疫疗法的关键。
背景介绍
相信大家已经发现T细胞耗竭成为了最近热点研究课题，今天小编为大家带来的这篇文章，作者对来自30种癌症类型的的9564个肿瘤样本的TEX亚型进行了全面的泛癌分析，文章发表在《eBioMedicine》上，影响因子为11.205，文章题目为：Pan-cancer landscape of T-cell exhaustion heterogeneity within the tumor microenvironment revealed a progressive roadmap of hierarchical dysfunction associated with prognosis and therapeutic efficacy。
数据介绍
本研究获取了TCGA数据库中30中癌症类型的临床病理数据、拷贝数数据、突变数据、表达数据、甲基化数据等信息。还从GSE159251获取了三个晚期黑色素瘤样本的 10X 单细胞 RNA-seq 数据。
技术路线
本研究技术路线如图所示。
结果解析
01
TEX在泛癌中的动态进展路线
为了量化TCGA中来自30种实体肿瘤类型的9564个肿瘤样本中TEX的含量，本研究通过文献挖掘建立了TEX特异性通路的简编，包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-2、干扰素-g (IFN-g)和细胞毒性通路。然后本研究使用ssGSEA从单个大块肿瘤组织样本的 RNA 测序数据中解构活跃的 TEX 特异性通路谱。通过层次聚类，从活跃的 TEX 特异性通路谱中揭示了五个主要的 TEX 驱动的泛癌簇，称为 C1-C5（分别为 1667、1401、2475、3303 和 718 例；图 1a）。
接下来本研究检查了 TEX 亚组与其免疫细胞溶解活性 (CYT) 之间的关系。从 TEX 亚组 C1 到 C5的进展 ，CYT 评分显著递减，浸润的 T 淋巴细胞丰度，如 CD8 T 细胞、Th1、Th2 和 Th 17 CD4 T 细胞，TEX 从 C1 到 C5 的每一个推进阶段都有所减少（图 1b），并观察到 TCF1 和 T-bet 的表达模式在五个 TEX 子组中存在显著差异并呈下降趋势， TOX 从 TEX C1 到 C4也呈下降趋势，但在 C5 中最高（图 1c）。
图 1
此外，T 细胞抗原受体 (TCR) 信号和 B 细胞受体 (BCR) 信号在 TEX 的每个阶段都逐渐增加，此前已发现这是 TEX 的主要驱动因素（图 1d）。这些结果表明，从本研究得出的五个 TEX 亚组可以准确地代表 TEX 分级阶段的生物学特征（图 1e）。这五个阶段分别被称为TEXprog、TEXint1、TEXint2、TEXint3、TEXterm。
接下来本研究进一步研究了TEX亚组与肿瘤类型和现有分子亚群的关系，结果发现，尽管TEX亚组跨越了不同的肿瘤类型和解剖位置，但不同的TCGA亚组和个体瘤类型在TEX亚群的组成上存在很大差异(图1f-g)，比如 TEXint2 亚组在乳腺浸润癌 (BRCA)、结肠腺癌和 HNSC 中富集。此外，本研究还发现 GBM、LGG 和 ACC 的 CpG 岛甲基化表型 (CIMP)-low、CIMP-intermediate、CIMP-high 亚型、LGG 和 GBM 的毛细胞星形细胞瘤样亚组在 TEXterm 亚组中特别丰富（图 1h ）。总之，这五个TEX亚组代表了TEX过程下的分级功能障碍的动态路线图，可用于横断面传统癌症临床病理分类，以揭示更多信息的免疫亚组。
02
TEX分级功能障碍异质性对癌症预后的影响
为了检查 TEX 分级功能障碍对临床结果的影响，本研究在泛癌水平和每种癌症类型中评估了TEX 亚组的预后价值。泛癌生存分析显示，不同 TEX 亚组肿瘤的总生存率(OS)有显著差异（图 2a）。通过癌症类型特异性生存分析还揭示了在一些癌症类型中TEX亚组和OS之间的显著相关性。如图 2b 所示，在SKCM和HNSC中，与其他TEX亚组相比，TEXprog亚组患者的生存率显著提高，在其他癌症类型中趋势与之相反；TEXterm 亚组与良好的预后相关，而 TEXprog 似乎与 LGG、胰腺癌 (PAAD)、葡萄膜黑色素瘤 (UVM) 和 THYM 的不良预后相关。
图 2
然后本研究检查了TEX亚组和浸润免疫细胞之间潜在相互作用对患者预后的影响。如图2c所示，除TEXterm亚组外，大多数浸润的免疫细胞与不同TEX亚组的存活呈正相关或负相关。在TEXterm亚组中，共有5个免疫细胞亚群(Th1, Th2, Th17，单核细胞和M0巨噬细胞)被发现与生存显著相关，例如Th17细胞的高浸润与TEXprog、TEXint1和TEXint2亚组的生存率提高有关，但与TEX int3和TEXterm亚组的生存率低有关(图2d)。
接下来，本研究探讨了TEX亚组和癌症相关信号通路之间相互作用对患者预后的影响。如图2e所示，TEX亚群与标志性癌症信号通路之间的串扰可以介导对癌症患者预后的显著影响。例如，氧化磷酸化通路高度活跃的患者在不同TEX亚组中往往表现出更好的预后(图2f)，在TEXprog亚组中，TGF-b和b趋化因子通路高度活跃的患者往往预后较差(图2g和h)。这些结果表明TEX分级功能障碍的异质性可能影响癌症预后，可作为癌症患者预后的可行预测指标。
03
基于TEX的亚组显示出不同的免疫微环境
为了研究耗竭过程中 CD8 T 细胞的五个 TEX 亚群中的每一个中的干细胞样特性，本研究使用干细胞特征基因富集评分 和 CD69 表达水平来估计它们在个体患者中的祖细胞样表型和增殖能力。结果发现从 TEXprog 到 TEXterm 的干细胞特征基因的富集得分和 CD69 表达水平动态降低，这表明在 TEX 期间发生的这种分级功能障碍与祖细胞样特征和增殖能力降低有关（图 3a）。
接下来，本研究使用 CIBERSORT 细胞反卷积方法根据免疫细胞类型检查区分的 TEX 亚组之间的差异。此前Charoentong等人报道的signature也被应用于使用ssGSEA方法验证TEX组中免疫细胞组成的检测结果(图3b)。ssGSEA分析显示，随着从TEXprog到TEXterm的分级功能障碍的进展，免疫微环境中的大多数免疫细胞类型都表现出从免疫富集到免疫耗竭的下降状态(图3b)。如图3c所示，前三类免疫细胞类型包括先天免疫和适应性免疫。分别为M2巨噬细胞、CD8 T细胞和静止CD4 记忆T细胞。TEXprog中CD8 T细胞、活化CD4 记忆T细胞含量最高，M2巨噬细胞含量最低。促进肿瘤的M2表型和肥大细胞的组成(图3c和d)在TEXterm中显示出比其他TEX组更大的范围。
图 3
先天免疫分数 (IF) 不仅在 TEX 亚组之间存在显著差异，而且在肿瘤类型之间也存在显著差异。IF 中 33% 的肿瘤包括对免疫检查点抑制剂 (ICI) 最敏感的肿瘤，例如 LUSC、LUAD、膀胱癌，特别是 LUAD.6 亚组、分泌亚组的 LUSC 和 BLCA.4 亚组（图 3e)。LGG 和多形性胶质母细胞瘤具有比其他肿瘤类型更高的 IF，表明在这些 TIMEs 中小胶质细胞的存在或缺失（图 3e）。在 IF 排名最高、最低和中间的三种代表性癌症类型中，每个 TEX 亚组中先天免疫细胞和 CD8 T 细胞的比值显著不同（图 3f）。
从富含基质的肿瘤（包括肉瘤、PAAD 和 KIRC）到基质贫乏的肿瘤（例如 LGG 和 UVM），基质评分因肿瘤类型而异（图 3g）。在 LGG 中，基质评分与 CD8 T 细胞的数量呈负相关，而在 PAAD和UVM 中显示相反的趋势（图 3h）。
04
根据TEX分类的泛癌亚组中的多组学改变
为了研究 TEX 过程中发生的层次功能障碍的分子特征，本研究对五个 TEX 亚组之间的基因组变异、基因表达和 DNA 甲基化谱进行了比较分析。通过比较基因组改变，观察到 TEXterm 子集具有较低的突变负荷、拷贝数改变 (CNA) 负担和基因组不稳定性（图 4a-c）。这些结果揭示了导致 TEX 的分级功能障碍过程中的基因组改变。
接下来本研究探究了 TEX 亚组中 568 个癌症驱动基因的表达谱，确定了 40 个与 TEX 相关的癌症驱动基因。其中，40 个与 TEX 相关的癌症驱动基因中有 31 个表现出从 TEXprog 到 TEXterm 的表达水平逐渐降低，伴随突变、CNA和DNA甲基化频率的增加。还发现 40 个与 TEX 相关的癌症驱动基因中有 22 个与 ICI 相关，26 个基因与免疫逃避密切相关，3 个基因与抗肿瘤免疫相关（图 4d）。
图 4
通过对 40 个 TEX 相关癌症驱动基因的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络分析，本研究确定了一个由 28 个 TEX 相关癌症驱动基因组成的 TEX 相关子网络。它们包括 tolloid-like 1 (TLL1)、肌球蛋白重链 11 (MYH11)、P2Y 受体家族成员 8 (P2RY8) 和蛋白激酶 D2 (PRKD2)，它们在癌症免疫治疗和免疫反应调节中的作用仍然未知（图 4e ）。这四个基因在五组之间的表达模式显著不同，同时在发生 TEX 发生时的分级功能障碍中的表达水平也逐渐降低（图 4f）。GO和KEGG功能富集分析表明，除了病毒感染之外，这个与 TEX 相关的子网络与 T 细胞介导的细胞毒性、T 细胞激活和 T 细胞分化有关（图 4g ）。
接下来本研究检查了四种 TEX 相关基因在介导抗 PD-1 免疫治疗反应中的作用。在无应答组中表达最高的 TLL1 的表达水平差异显著，但在应答组中表达最高的 P2RY8 和 PRKD2 的表达水平差异显著（图 4h），表明这些基因可以调节抗肿瘤免疫反应。
05
用于建模分级TEX阶段和预测免疫治疗效果的基因特征
为了进一步探索在单细胞分辨率下鉴定的 40 个 TEX 相关癌症驱动基因与 5 个 TEX 阶段之间的关联，本研究分析了来自 3 名黑色素瘤患者的免疫细胞的单细胞转录组数据。使用 tSNE 将 10,518 个免疫细胞聚集成 17 个主要免疫细胞簇，用已有的 TEX 标记基因对 PD-1、粒酶 A (GZMA)、粒酶 B (GZMB)、C-X-C 基序趋化因子配体 13 (CXCL13) 等细胞类型进行注释，鉴定出 17 个主要免疫细胞簇中的 9 个与 TEX 相关联，称为 TEX-C1-C9（图 5a-c)。TEX 相关癌症驱动基因的表达谱显示了这些 TEX 相关细胞类型中的分层和差异组成（图 5c），并将这些 TEX 相关细胞类型分类为五个 TEX 亚组（图 5d）。随后，本研究使用深度神经网络“自编码器”来评估每个与 TEX 相关的癌症驱动基因的重要性。根据自编码器，每个与 TEX 相关的癌症驱动基因的显著性超过 75%，这意味着它们在定义 TEX 亚组时必不可少（图 5e）。
图 5
对于每种癌症类型，本研究使用 8:2 的比例将泛癌数据随机划分为训练和测试队列。接下来本研究开发了一个基于机器学习 (ML) 的预测模型，称为 ML-TEX，在训练队列中使用 40 个与 TEX 相关驱动基因和最新模型来推断大块肿瘤样本中的 TEX 分级阶段，包括 XGBoost、多元logistic、随机森林、支持向量机和前馈神经网络（图 5f）。最后，本研究发现基于 XGBoost 的 ML-TEX 在预测训练队列中的 TEX 分级阶段方面取得了优异的性能，具有不同 TEX 预测严重程度的患者的 OS 存在显著差异，表明 ML-TEX 可用于预测泛癌生存率（图 5g）。
为了确定 ML-TEX 是否可用于预测免疫检查点阻断 (ICB) 治疗的反应，本研究将 ML-TEX 应用于不同的免疫治疗组，并将接受 ICB 治疗的患者分为不同的 TEX 亚组。如图 5h 所示，TEX 相关的癌症衍生基因在不同 TEX 亚组患者中表现出连续的转录状态谱。具体来说，在从 TEXprog 到 TEXterm 的过渡期间，PD-1、PD-L1 和 CTLA4 的表达水平逐渐降低（图 5i）。ICB治疗的应答者百分比在不同TEX亚组间差异显著，其中 TEXint2 的反应者百分比最高，而TEXprog 到 TEXterm 的其他四个 TEX 组的反应者百分比呈下降趋势（图 5j ）。随后本研究在五个 TEX 亚组中评估了 ICB 治疗的临床结果，发现在显示反应的组中，特别是 TEXprog、TEXint1 和 TEXint2，与无反应组相比，观察到更长的 OS（图 5k)。这些结果表明 ML-TEX 作为预测 ICB 治疗后患者的反应性和存活率的有益工具具有广阔的前景。
小编总结
本研究得出了一个动态的、渐进的路线图和TME内TEX的分级功能障碍景观，确定了5种泛癌TEX亚型，揭示了低免疫原性肿瘤中的癌症类型特异性TEX模式。相比之下，高免疫原性肿瘤往往含有高频率的TEX祖细胞亚群。此外，TEX谱还揭示了不同癌症的预后、内在分子亚型分布、免疫微环境和多组学特征。网络分析确定了4个之前未知与TEX相关癌症基因，并使用单细胞数据集验证了其与抗PD-1免疫治疗反应的可能关联。最后，本研究开发了一种基于机器学习的基因特征来建模分级TEX阶段，并在单细胞和免疫治疗患者队列中进行了验证。
本研究限制在于：首先，应进行进一步的分子实验以研究 TEX 中确定的其他候选者的功能作用。其次，本研究只测试和比较了几种常用的机器学习方法来推断大块肿瘤样本中的分层 TEX 阶段，应该在未来进行测试。第三，考虑到不同恶性肿瘤和研究中 T 细胞耗竭和其他生物学特征之间的复杂相互作用，应在前瞻性研究和更多癌症类型中测试和验证所提出的 TEX 衍生的免疫治疗效果预测因子 ML-TEX。总之，T细胞耗竭的相关思路均在本研究中有所体现，值得对T细胞耗竭感兴趣的大家进行学习借鉴！
