研究背景
肾脏疾病已成为现代社会的主要健康问题。慢性肾病(CKD)是全球第十大死亡原因，其发病率稳步上升，影响着全球8亿人[1]。全基因组关联研究(GWAS)和功能基因组研究的整合强调了近端小管(PT)特异性基因在肾功能中的作用。无论是在患者还是小鼠CKD模型中，细胞代谢，如参与脂质代谢、脂肪酸氧化(FAO)和氧化磷酸化(OXPHOS)的基因都与疾病状态有很强的相关性。然而，确切的机制还没有完全弄清楚[2]。单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析正在改变人们对复杂疾病的理解。本研究对CKD小鼠模型、人类肾脏样本和人类类器官进行scRNA-seq，深入研究了PT细胞在健康和疾病条件下存在的不同分化状态，为预防肾脏疾病提供理论基础。
方法流程
本研究使用单细胞RNA测序解析受损的肾脏组织细胞组成上的差异，并在小鼠肾脏疾病模型中解析细胞类型特异性基因表达，确定PT细胞为关键的易损细胞类型。然后通过无偏细胞轨迹分析，研究人员发现在肾脏疾病中PT细胞分化发生了改变。PT细胞中的代谢（FAO和OXPHOS）与PT细胞的分化和疾病呈现出最强且最可重复的关联。最后，研究人员证实核受体（ESRRA）通过直接调控PT细胞特异性基因来维持PT细胞的代谢和分化，并预防肾脏疾病。
研究结果
1纤维化肾脏的免疫细胞多样性增加
为了揭示与肾纤维化相关的细胞变化，研究者分析了6个正常小鼠对照肾和2个叶酸(FA)诱导的纤维化肾(叶酸肾病[FAN])的65,091个细胞的转录组。聚类鉴定了30个细胞群，包括肾上皮细胞、免疫细胞和内皮细胞，其中PT细胞占比最高。对照组和FAN组之间细胞比例存在显著差异，FAN小鼠的免疫细胞多样性显著增加。
图1 纤维化肾脏样本的细胞多样性
2纤维化肾脏的细胞组成和细胞类型发生特异性改变
接下来对全肾样本进行Bluk RNA测序，FAN模型表达量最高的基因大多数仅由免疫细胞表达。FAN模型中表达水平较低的基因在代谢过程中富集，主要由PT细胞表达，表明PT细胞和免疫细胞在驱动转录变化中发挥强大作用。Bluk RNA-seq数据和单细胞RNA-seq数据得出了一致的结论，即FAN模型具有较高的免疫细胞比例和较低的上皮细胞比例。
图2 肾纤维化的细胞组成和细胞类型特异性改变
3纤维化期间PT细胞的异质性
对健康和患病样本PT细胞进行亚聚类和细胞轨迹分析。在健康对照组中，鉴定了5种PT细胞亚型，PT细胞分化为两种主要的细胞类型:PCT（近曲小管，表达Slc5a2和Slc5a12）和PST（近直小管，表达Slc22a30）。在FAN组中，鉴定了9种PT细胞亚型，发现了一个显著的增殖细胞群(即ki67阳性)。PCT细胞共表达PST标记物，这表明在疾病条件下，PCT细胞可能会经历影响其表型特征的转录组变化。这与对照样本中观察到的结果相似。
图3 PT细胞的异质性
4纤维化PT的分化缺陷与脂质代谢的变化
FAN样本在最终分化的PT细胞中明显减少，表明FAN样本中终末分化标志物水平较低，并且发现脂质代谢与细胞分化呈正相关。在单侧肾纤维化输尿管梗阻(UUO)模型的scRNA-seq数据也观察到UUO肾脏中选择性地缺乏终分化PT细胞，这与FAN模型得出的结果相一致。
图4 细胞轨迹分析可识别纤维化时PT的分化缺陷
5肾类器官的PT分化与代谢变化相关
研究者测试了FAO和OXPHOS在发育中的肾类器官小管细胞分化中的作用。由SIX1阳性祖细胞分化而来的细胞获得了PT细胞标志物SLC3A1的表达。分析沿该轨迹表达变化的基因，发现分化标志物如溶质载体的表达沿该轨迹增加，并且它们的表达与FAO中包括PPARA（氧化物酶体增殖因子活化受体A）在内的基因有很强的相关性，即肾类器官的PT分化也与代谢变化相关。
图5 FAO和OXPHOS促进人肾样器官的PT分化
6ESRRA在小鼠模型中驱动近端小管分化和代谢
基因集富集分析显示PT特异性的PPARA和ESRRA靶基因富集于肾脏发育、脂质代谢和上皮转运功能。ESRRA降低导致PT分化基因表达降低。总的来说，ESRRA抑制对PT的分化有负面影响，即ESRRA在小鼠模型中驱动近端小管分化和代谢。
图6 ESRRA驱动PT分化状态并保护肾脏
7ESRRA驱动的代谢变化与患者样本中肾脏疾病的严重程度相关
在CKD患者中，相关性分析显示脂质代谢基因表达与PT细胞分化呈正相关，与纤维化呈负相关。在对91个人体样本的bulk转录组数据进行分析，显示出纤维组织中PCT和PST细胞的比例下降。最后，研究者检查了431个解剖人体肾脏中ESRRA及其靶基因的表达情况。ESRRA在疾病样本中的表达较低，且EGFR和肾纤维化密切相关。
图7 在患者样本中，ESRRA驱动的代谢变化与肾脏疾病的严重程度相关
研究结论
本研究使用scRNA结合bulk RNA测序、表观基因组分析等方法证明PT细胞在健康和疾病条件下存在不同的分化状态。研究结果强调了PT细胞代谢是PT细胞分化的主要驱动因素之一，ESRRA通过直接结合和调节PT基因的表达，在加速代谢和分化过程中发挥中心作用。此外还描述ESRRA驱动的PT代谢和分化以及ESRRA在保护肾脏免受损伤中起着关键作用。
参考文献
Dhillon P, Park J, Hurtado Del Pozo C, Li L et al. The Nuclear Receptor ESRRA Protects from Kidney Disease by Coupling Metabolism and Differentiation.[J] .Cell Metab, 2020.
