肿瘤内异质性对癌症患者的准确诊断和建立个性化治疗策略带来了重大挑战。这种异质性可能是治疗耐药性、疾病进展和癌症复发的基础。为了提高免疫治疗效果，研究人员使用空间转录组技术(spatial transcriptome，ST)来识别,阻断肿瘤异质性的来源，提供识别新的生物标志物的能力，并深入了解肿瘤细胞、脂肪组织、血管、三级淋巴结构和TME间基质之间的动态相互作用。目前多项技术已经被应用于癌症组织内的这种分析，包括，原位杂交,数字空间分析以及一种新兴技术的空间基因表达解决方案。将定量基因表达数据，并将它们映射到组织结构上。通过保留空间信息可以很好地识别新的生物标志物，该技术可能会影响新的组合免疫疗法。
多重免疫组化/免疫荧光(mIHC/IF)是一种常用的工具，可同时检测单个组织样本中多达40个感兴趣的标记物。与单独分析肿瘤突变负荷(TMB)或基因表达谱(GEP)相比，这种方法能更好地预测细胞对PD-1/PD-L1治疗的反应。
下面为大家介绍几种空间转录组技术，及各种技术的特点：
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原位杂交技术（In Situ Hybridization，ISH）
原位杂交(ISH)是一种在细胞或组织中可视化特定DNA或RNA分子的分子技术。ISH是基于互补性质的DNA/DNA或DNA/RNA双链和标记核酸探针的原位杂交到靶序列上。通过这种方式，我们可以获得有用的空间信息。传统方法，核酸探针附着在放射性标签上。目前这种方法已被萤光颜料所取代。也就现在大家所熟知的荧光原位杂交技术（FISH）。FISH本身已经进一步发展成为一种被称为多重单分子FISH (smFISH)的技术，它能够在单分子分辨率下同时检测大约10,000个基因和每个细胞大约70,000-100,000个RNA分子。下面为大家概述每种技术的基本原理：
荧光原位杂交（FISH）
FISH是检测微生物、诊断实体癌症和血液癌症以及指导癌症治疗的有用的临床工具。例如，FISH已被常规用于检测慢性髓系白血病中的BCR-ABL1 t(9;22)易位和各种癌症中的许多融合基因。FISH还被用于确认乳腺癌中的人表皮生长因子受体2 (HER2)基因扩增，从而识别最有可能从曲妥珠单抗(一种针对HER2的单克隆抗体治疗)中获益的患者。随着更多免疫疗法的开发和批准，研究人员已经寻求使用FISH来预测癌症免疫治疗的反应性。为了扩大FISH的有效性，将FISH与IHC或IF结合，同时检测不同细胞类型的RNA和蛋白质，可以更好地来表征TME。
Single-Molecule FISH（smFISH）和RNAscope
为了解决传统FISH的局限性，研究工作已经从DNA研究转向了单分子RNA的研究，并且使用高通量的方法。由此产生的技术，称为单分子FISH (smFISH)，允许研究人员可视化和量化单个mRNA分子，并表征内源性基因表达的空间模式。
RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA)是一种商业化的基于ISH的技术，使用分支DNA和信号放大实现比传统FISH更好的灵敏度和特异性:通过这种方法，研究人员可以在抑制背景噪声的同时检测和量化低含量的mRNA。这种方法可以检测多达12种不同的RNA靶点，可以方便地与免疫组化和/或IF结合，以自动化的方式同时研究RNA和蛋白质。RNAscope相对于其他基于FISH的技术的一个主要优势是，13000个RNA探针已经被设计并通过商业建立的协议进行验证;因此，它是一种用于研究和临床实验室的省时和友好的方法。通过检测一种感兴趣的特定RNA, RNAscope已经揭示了TME、免疫逃逸机制和新的预测和预后癌症生物标志物。
Multiplexed smFISH
虽然研究人员可以通过RNAscope等技术获得更高的敏感性和特异性，但最终需要一种基于FISH的高通量转录组分析技术来更好地表征具有独特基因表达谱的罕见细胞群和细胞类型。比如多重纠错FISH(MERFISH)和序列FISH(seqFISH)，不仅提供了改进的RNA定量、信号放大和检测，而且更重要的是，提供了基于图像的转录组分析。
MERFISH由smFISH改良而来，采用基于条形码的组合标记方法，随后进行多轮杂交，以确保高水平的荧光信号亮度和可同时检测到的大量RNA (图1)。MERFISH可以实现接近全基因组分析和90%的检测效率，在人类骨肉瘤细胞中已经证明。与传统的FISH相比，MERFISH还提供了额外的好处，即能够以低丰度量化单个RNA分子。
图 MERFISH原理
seqFISH是另一种多重smFISH技术，它是基于连续多轮的条形码杂交标记技术。它可以提供亚衍射极限的空间分辨率，优于其他RNA分析技术。例如，seqFISH对小鼠胚胎干细胞和脑组织中的10000种mRNA进行了高精度、高分辨率的成像。Zhou等人证明seqFISH是一个研究和获得t细胞成熟过程中调控基因表达动态的强大工具。最近，Voith von Voithenberg等人将微流体技术与多路smFISH相结合，研究乳腺癌中的肿瘤异质性。
图 seqFISH原理
smFISH和多重smFISH是单细胞RNA测序研究和量化细胞RNA的替代方案，因为它提供了单细胞甚至单分子水平上的亚细胞空间信息。然而，尽管基于smFISH的多重技术很有前景，但由于复杂的探针设计、验证、图像分析和解码，它还没有广泛应用于转化研究或临床设置。通常使用非多重FISH、定量PCR、免疫组化、IF等方法在mRNA或蛋白水平上研究单个基因表达更为方便，特别是当研究的基因数量较小时，如一套预后标志物。另一个限制是, 与其他技术相比，因为序列杂交,成像时间加起来至少18 h，还不包括最初的36-48 h的探针杂交时间,导致整体的通量较低 (表)。此外，多重smFISH技术只能评估新鲜冷冻组织中一种类型的分析物，如RNA。新兴的技术，如数字空间分析，可以评估新鲜冷冻组织和病理医师经常使用的标准福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中的蛋白质和RNA水平。
表：多种空间转录成像技术对比
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空间转录组（Spatial Transcriptomics，ST）
在单细胞RNA测序过程中，空间信息丢失。尽管该技术被广泛用于探索单细胞水平的基因表达谱，但它的捕获效率和测序覆盖率较低，以及高丢失率，这些都可能影响后续数据的分析和解释。
随着一家名为“空间转录组学”(Spatial Transcriptomics，Stockholm, Sweden)的公司率先开发的技术的发展，空间基因组学这一新兴领域进入了人们的视线。该技术利用空间条形码寡脱氧胸腺嘧啶微阵列实现完整组织切片中的转录组定量可视化和分析。在进行RNA测序过程之前，将独特的位置条形码引入玻片，以保持组织结构中的空间位置。
图Visium Spatial Gene Expression Solution原理
这项新技术首先在小鼠嗅球上进行，包括组织包埋，组织切片、固定、苏木精和伊红(H&E)染色、亮视野成像、组织通透化、cDNA合成、组织移除、探针释放、文库准备、测序、数据处理、数据可视化和分析。值得注意的是，该工作流程的一个显著特征是能够生成带有保留空间信息的载玻片cDNA文库，使其能够可视化地将基因表达谱映射到相应的组织形态。
目前该技术已经用于多种疾病类型，包括研究人员在乳腺癌、前列腺癌和皮肤恶性黑色素瘤活检中发揭示了肿瘤内部及之间的异质性,以及癌和癌旁间差异的基因表达谱。当然，组织病理学注释和单细胞RNA测序可以分别识别异常的组织形态和确认存在遗传上不同的细胞群;然而，ST可以根据基因表达谱来识别不同的空间区域。基于空间转录组公司首创的概念，Visium Spatial Gene Expression Solution与第一代ST技术相比，Visium Spatial Gene Expression Solution具有更高的分辨率和更高的灵敏度。为了进一步挖掘ST的潜力，研究人员最近开发了一种被称为多模态交叉分析(MIA)的分析方法。MIA结合了单细胞RNA测序和ST技术生成的数据集，可以将细胞定位到组织上特定的区域。
尽管Visium Spatial Gene Expression Solution为科学研究带来了很大的希望，但它仍然有局限性。首先，尽管官方推荐的最佳组织切片厚度是10µm，但是这个值还要取决于组织类型和成分。10×Genomics提供了一个支持网站，上面提供了兼容组织和相应厚度的更新列表。到目前为止，已经列出了4种大鼠组织、20种小鼠组织和19种人类组织，还有4种组织计划进一步优化。此外，建议对每一种新的组织类型进行一次优化实验，因为组织通透性条件在组织、物种甚至实验室之间是不同的。其次，Visium仅在新鲜冷冻标本中得到验证，针对于FFPE标本的解决方案也会在不久后推出。最后,每个组织捕获区域包含~ 5000个spot点，根据组织类型和厚度的不同，每个点可以捕获1-10个细胞。虽然有些人可能认为这项技术令人满意，但在需要获得详细细胞类群信息时仍需要做额外的工作。最好的解决方案是将MIA分析方法集成到分析工作流中，以允许在细胞级别进行识别。尽管存在这些限制，但由于visium可以迅速识别基因表达谱，并在不丢失空间信息的情况下检测出癌症起始和进展的新特征，因此visium技术是目前最有潜力及前景的技术。
参考文献：
Nerurkar S N, Goh D, Cheung C C L, et al. Transcriptional Spatial Profiling of Cancer Tissues in the Era of Immunotherapy: The Potential and Promise[J]. Cancers, 2020, 12(9): 2572.
