在活细胞中实时监测内源基因活性对于研究基因的生物学功能及其表达水平至关重要。基因组中编码蛋白质的基因只有1%-2%，大部分为非编码RNA。其中lncRNAs(Long non-coding RNAs)具有非常重要的调控功能， 多达78% 的lncRNAs表达具有组织特异性【1】。近年来越来越多证据表明，lncRNAs不仅参与各种生物学过程和通路，而且与各种疾病的发生发展紧密相关。但是受现有标记技术的限制，对其功能注释极具挑战性。
监测内源基因活性的常规方法是将荧光蛋白精确插入蛋白编码框中，但是，这种方法并不适用于非编码基因和低丰度转录的基因。sgRNA，类似于一个GPS可以将Cas核酸酶直接导向目标核酸位点，具有高特异性、高效率和多功能性【2】。尽管各种诱导性sgRNA已经被开发用来接收活细胞中的内源信号，但这些方法只能用于某些功能明确的小RNA的反应【3-5】。目前在活细胞里面标记内源基因表达的方法，都具有一定的局限性，而且，对于低表达的基因以及lncRNA，目前缺乏很好的活细胞内的标记技术。建立适用范围更广，能增强内源信号，并且信噪比更低的新型活细胞标记技术，是该研究领域急需解决的问题。
2021年1月4日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和周海波研究组合作在Nature Cell Biology在线发表了题为“Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundant genes and lncRNA”的研究论文。该研究通过内源基因的启动子驱动sgRNAs（single-guide RNAs）表达，结合SPH-OminiCMV（CRISPR-activator Suntag-P65-HSF1 and OminiCMV-mCherry）荧光报告系统【6】，成功实现低丰度基因和lncRNAs基因表达的动态示踪。该研究建立了一种通用的内源基因转录门控系统，为活细胞中实时标记低表达基因和lncRNAs，研究其生物学功能提供了有效工具。
该研究中，研究人员首先优化了高度敏感的CRISPR激活相关的报告系统，命名为SPH-OminiCMV。然后在小鼠胚胎干细胞上建立了SPH-OminiCMV的稳转株（图1A），接着选择在Actb基因的第一个内含子区域用SaKKHCas9介导了三种不同的sgRNA释放机制，分别是：miR30【7】, autosplicing【8,9】 or tRNA【10-12】（图1B）。结果显示只有tRNA能够有效地诱导报告系统中的mCherry表达。如先前报道的【10-12】，可以将tRNA-sgRNA-tRNA前体插入外源基因中，并通过内源酶RNase P和RNase Z在特定位点精确切割，然后释放sgRNA。那么，在内源基因的什么位置导入tRNA-sgRNA-tRNA前体才能诱导报告系统更好的表达呢？以及是否会对内源基因的表达造成影响呢？为了回答这两问题，研究人员在Nanog基因的不同位点导入tRNA-sgRNA-tRNA前体，实验结果显示在3’UTR的效果更好并且更加稳定，并且western blot的结果显示对内源基因的表达量基本没有影响（图1C-F）。
图1：（A）小鼠胚胎干细胞上建立了SPH-OminiCMV稳转株。（A）在Actb的第一个内含子导入三种不同的sgRNA释放机制。（C）在Nanog基因的不同位点导入tRNA-sgRNA-tRNA前体。（D）不通导入位点诱导报告系统mCherry的表达情况。（E）Nanog基因的不同位点导入tRNA-sgRNA-tRNA前体后对nanog的蛋白表达量进行检测。
就此杨辉研究组和周海波研究组合作开发了一种广谱的内源性转录门控开关Ents（Endogenous Transcription-Gated Switch），利用内源性启动子表达sgRNA前体，之后sgRNA前体上的tRNA序列可以被内源的自剪切机制识别并且切割，进而释放出能够执行功能的sgRNA，当Ents与高度敏感的CRISPR激活相关的报告系统SPH-OminiCMV结合，可以监测到内源基因的表达（图2A）。值得注意的是，SPH-OminiCMV-Ents能够放大内源信号，从而实现低丰度转录本表达的可视化。
为进一步研究SPH-OminiCMV-Ents用于监测内源基因的能力，团队选取了表达量从高到低的八个基因，发现SPH-OminiCMV-Ents诱导的mCherry表达水平普遍高于常用的P2A-mCherry标记策略，尤其是P2A-mCherry策略标记后在荧光显微镜下几乎无信号的低丰度表达基因Sox2、Tet1、Sall4、Tbx3等（图2B）。
为探讨增加sgRNA拷贝数是否会进一步增强荧光蛋白的产生，团队构建了一个sgRNA前体，包含六到八个串联的sgRNA拷贝，每个sgRNA的两侧分布着tRNA序列（图2C）。研究表明，插入sgRNA阵列可以对低丰度基因实现更好的监测，比如lncRNA Tug1，当仅用一个拷贝的sgRNA的时候不能监测到其表达，但使用sgRNA阵列则可以（图2D,E）。
为进一步探讨此方法的特性，团队成员建立了一个可控的Tet-on系统，该系统可以通过调节dox的浓度，实现EGFP基因不同程度的表达量，进而用来研究报告系统的荧光信号强度是否可以很好地反映目标基因的表达水平。研究发现，报告系统的mCherry表达量和EGFP基因的表达量有很强的相关性，并且进一步探索了此报告系统和目标基因表达在转录本水平和蛋白翻译水平存在的时间差（图2F）。
图2：（A）示意图显示P2A-mcherry和SPH-OminiCMV-Ents两种标记基因的策略。（B）在mESC细胞中用SPH-OminiCMV-Ents策略（红色三角形）和P2A- mCherry策略（绿色菱形）标记不同的基因，统计其mCherry荧光信号强度以及用qPCR分析这些基因的表达水平（紫色圆圈，紫色y轴）。（C）示意图显示插入一个sgRNA或一个sgRNA阵列的标记策略。（D，E）Fish图像显示对lncRNA Tug1在3'UTR中插入一个sgRNA或一个sgRNA阵列后，细胞系中mCherry报告荧光信号的表达情况。（F）可控的Tet-on系统示意图，Dox诱导EGFP-sgRNA前体转录，成熟的sgRNA释放出来激活mcherry报告系统。
那么对于内源基因的表达变化，该系统是否也能灵敏地检测到呢？研究人员在体外对SPH-OminiCMV-Ents-Actb ，Actb-P2A-mCherry，SPH-OminiCMV-Ents-Nanog 和Nanog-P2A-mCherry四株细胞系进行了分化实验【13】。再分化进程中，Actb的表达量不会改变，Nanog的表达量逐渐降低，而报告系统的mCherry表达量和目的基因的表达变化是一致的，这说明这一系统能够反映内源基因表达的动态变化（图3A-D）。
图3：（A）-(D) SPH-OminiCMV-Ents-Actb ，Actb-P2A-mCherry，SPH-OminiCMV-Ents-Nanog 和Nanog-P2A-mCherry四株细胞系在分化进程中，报告系统中mCherry的表达情况变化图和Actb，Nanog内源基因mRNA水平表达的变化情况。
该研究创新开发了由内源性启动子驱动的高度可编程的sgRNA门控开关Ents，此系统理论上可以处理任何转录本的信息。研究人员将Ents与SPH-OminiCMV结合使用，在小鼠胚胎干细胞水平上实现了对低丰度基因和lncRNA的可视化监测及其动态变化的监测，未来的工作会进一步应用于动物体内。该研究为在活细胞中研究基因元件的功能开辟了新途径，为描绘基因表达的时空图谱和标记、鉴定特定的细胞类群带来新方法。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41556-020-00610-9
参考文献
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