1月12日，南通大学生殖医学研究院孙斐教授及其团队在《Human Molecular Genetics》期刊发表了人类精子发生过程中的单细胞ATAC测序最新进展，题为：Single cell ATAC-Seq reveals cell type-specific transcriptional regulation and unique chromatin accessibility in human spermatogenesis。
研究背景
在人类精子发生过程中，由精原干细胞起源的生殖细胞在染色质包装/重包装、转录组水平上均发生着动态变化，精原干细胞在自我更新与分化成精子中维持着动态平衡，但这种动态基因表达、染色质包装以及可及性之间的关系仍不清楚。研究报道，非梗阻性无精子症患者的生殖细胞存在不规律的基因组甲基化修饰，与精子发生过程中的基因表达大相径庭。因此，研究精子发生中染色质可及性与基因表达之间的关系，探究精子发生的调控机制，为生殖疾病的研究和治疗提供重要的参考依据。
方法流程
作者收集了来自健康成人的睾丸活检组织进行单细胞ATAC测序，并与公共数据库中的3名健康成人睾丸细胞的单细胞RNA数据进行对比，研究了精子发生不同阶段细胞的染色质和基因表达的动态变化。
研究结果
1、单细胞RNA测序公共数据
作者分析了公共数据库中的睾丸单细胞RNA测序数据，根据经典marker（图1B）共注释出10种生殖细胞和6种睾丸体细胞，在UMAP图上，生殖细胞成连续分布且按分化时间排列，而体细胞分布较分散（图1A）。10种生殖细胞分别是：精原干细胞、分化中精原细胞、分化完成精原细胞、细线期、偶线期、粗线期/双线期精母细胞、圆形精子、长形精子、精子1、精子2细胞。6种睾丸体细胞分别是：巨噬细胞、内皮细胞、睾丸间质细胞、肌细胞、睾丸支持细胞以及周细胞。
图1 scRNA-seq公共数据库中睾丸细胞类型及其marker
2、单细胞ATAC测序初步结果及其与单细胞RNA数据对比
对3例健康成人的睾丸细胞进行单细胞ATAC测序，质控之后共获得4,685个单细胞数据，共测得142,024个peaks值，其中定位在基因体上的peaks值最多，高达69,718个，大概是定位到启动子、CpG岛或TEs上的3倍左右（图2F）。将scATAC-seq与scRNA-seq数据整合，发现两种技术注释出的细胞类型一致，但比例存在一定差异（图2A, D, E）。相比于scRNA-seq只有75%是生殖细胞，scATAC-seq可获得更大比例的生殖细胞，约占90%。更重要的是，scATAC-seq技术下不同睾丸体细胞和生殖细胞的占比与已发表的数据更为相似，表明ATAC技术在评估人类睾丸细胞比例上更为可靠。
图2 scATAC-seq初步结果及其与scRNA-seq联合分析
3、精子发生不同阶段的染色质可及性分析
作者分析了所有染色质的可及性，发现精子发生不同阶段peaks数量存在明显差异，总体上呈现迅速上升——持续上升——突然下降的趋势，说明在精子发生早期及中期，基因表达被持续激活，而单倍体精子产生以后，基因表达被抑制（图3A）。此外，研究还发现，19号染色体和17号染色体是开放程度最高与次高的（图3B），分别支持着精子发生早期和晚期的基因表达（图3C, D）。
图3 精子发生不同阶段的染色质可及性分析
4、精子发生过程中的转录调控
由于单倍体精子染色质可及性降低，作者对精子发生早期和中期阶段的8种生殖细胞进行了motif分析，发现8种细胞中高频出现细胞分裂、增值等相关motif（图4A），而且大多数motif均富集在粗线期/双线期精母细胞中（图4B）。接着，分别对分化中精原细胞和粗线期/双线期精母细胞的染色质可及性及基因表达进行相关性分析，发现基因表达上调与染色质可及性的升高呈显著正相关。其中，作者对两个高表达基因TLE3和PFN4进行深入分析，发现它们分别在分化中精原细胞和粗线期/双线期精母细胞中特异性高表达，且该两个基因上游均存在高可及性区域，富含了染色质结构调节与细胞分化相关motif CTCF（图4C），表明了TLE3、PFN4在精子发生过程中的重要性。
图4 Motif分析及TLE3、PFN4基因上游区域的可及性
研究结论
本研究发现精子发生不同阶段细胞存在独特的染色质可及性及基因表达；在所有染色体中，19号和17号染色体的染色质可及性最高；与精子发生和减数分裂相关的基因TLE3、PFN4分别在分化中精原细胞和粗线期/双线期精母细胞中高表达，对应染色质区域同时呈现高可及性，其上游的独特区域也存在高度可及性，表明它们在人类精子发生过程中的重要性。本研究详细描述了精子发生各个阶段细胞的染色质和基因表达动态变化，对于非梗阻性无精子症等生殖疾病的研究有重要的参考价值。
参考文献
Wu X, Lu M, Yun D, et al. Single cell ATAC-Seq reveals cell type-specific transcriptional regulation and unique chromatin accessibility in human spermatogenesis. Hum Mol Genet. 2021 Jan 12:ddab006. doi: 10.1093/hmg/ddab006.
