高通量单细胞RNA测序现已广泛地应用到了各个领域当中，包括了解不同组织类型、疾病状态和不同时期样本中包含的多种细胞亚群以及它们的转录状态等。
但并不是所有的组织都适用于单细胞RNA测序，现阶段单细胞RNA测序研究的一个极大的挑战仍是如何获得高质量的单细胞悬浮液。高质量悬浮液的标准包括：组织中各种细胞类型都被解离在悬液中；细胞中的mRNA未降解；基因的表达不受解离的影响等。
而现实中往往不能得到非常理想的结果。例如，单细胞RNA测序不能准确地捕获组织中所有的细胞类型，或得到的样本为冷冻样本不能使用常规的单细胞测序方法等。
基于这些局限，现在多种平台也开展了单细胞核RNA测序，由于不受解离条件的限制，单细胞核测序的方法能更好地反应原始组织中的细胞组成和基因表达情况，且可用于冻存的样本。
但与单细胞相比，单细胞核的mRNA含量较低，因此人们对单细胞核测序的数据存在疑虑。本文将从各个角度比较单细胞RNA测序与单细胞核RNA测序之间的差异，旨在为科研工作者后期选择研究不同组织的测序方法提供依据。
细胞核内转录加工过程发生了什么？
真核生物的细胞核中含有3种RNA聚合酶，RNA Pol I 和Pol III 主要合成核糖体RNA和tRNA，RNA Pol II 合成编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA），ncRNA包含小核/小核仁RNA（small nuclear/nucleolar RNA，sn/snoRNA），小RNA （microRNA， miRNA），以及广义的长链非编码RNA（lncRNA）。我们最关心的就是Pol II 的转录产物。
转录开始后，生成的不同RNA产物往往有不同的命运，编码RNA大部分被输送到细胞之中，相反，许多ncRNAs留在核中最终被降解。新生的RNA会发生加5’端帽、内含子去除以及3’端形成等过程，在这个过程中，RNA始终受到核酸外切酶的威胁，最终成功输出到胞质中被降解，RNA命运决定的机制就存在于整个加工过程中。
5’端m7G帽的加入是RNA命运决定的第一步。其一，m7G帽可以防止新生RNA被5’-3’核酸外切酶降解；其二，m7G帽会招募可以跟它结合的CBC，并通过CBC结合其它下游蛋白，通过结合相应的因子，使pre-mRNA和snRNA/snoRNA分配至各自相应的出核定位通路（productive方向）；也可以通过结合另一些因子，使PROMOPTs、eRNA、部分sn/snoRNA、lncRNA等留在核内并最终降解（destructive方向）。（图1）
图1 RNA的命运（左）
图2 5’与3’端的保护机制（右）
剪切过程也对RNA有影响，剪接通常发生在Pol-II转录的延长期，在此过程中剪接体直接与许多输出因子相互作用，促进了出核的过程。RNA加工的最后一步是3’末端的形成和pol II 转录的终止。RNA3’末端加工影响核糖核蛋白（RNP）复合物的形成，从而影响转录物的命运。
所有的RNA加工途径都不断受到5’和3’核酸外切酶的威胁，末端修饰（如5’端修饰及3’端特殊结构形成）或者与RNA结合蛋白（RBPs）结合可以保护转录产物免受核酸外切酶影响，从而促进其在核内的稳定性。没有保护的RNA片段，例如剪切下来的内含子等，即可被外切酶降解从而保证RNA加工过程的质量控制。（图2）
除此之外，为了在细胞核中继续存活，一些RNA被隔离成为RNP聚集体，称为nuclear speckles和paraspeckles， 以逃脱降解的命运。还有一些RNA，通过自身的某些区域与染色质相结合来逃避降解。（图3）
图3 RNA通过隔离在亚核区域或与染色质相结合逃避降解
近年来，研究工作已经开始揭示RNA的核分类机制，以及哪些成分有助于区分RNA是随后出核到胞质中还是靶向降解。所有Pol-II转录本都可以作为降解的靶点，但是高效的加工、快速的输出和/或保护性的元素可能有助于转录本免于降解。事实上，降解可以被认为是RNA的默认状态，这是一场逃避这种命运的艰苦斗争。虽然看上去是一种浪费，但从长远来看，从进化的时间衡量，它确保了只有高质量的RNA能够生存下来，从而保持了转录组的稳定和可操作性。
比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞核RNA测序（snRNA-seq）
最近有研究组针对各种组织和疾病类型比较了scRNA-seq与snRNA-seq之间的差异。
2019年，来自华盛顿大学医学院的团队通过比较分析了肾脏组织利用dropseq和10x两种平台的scRNA-seq和snRNA-seq的区别，该研究成果发表在肾脏病学顶尖国际期刊J Am Soc Nephrol上（Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis）。结果显示，snRNA-seq的结果中包含了很多在scRNA中不存在的细胞类型，肾小球足细胞的比例增加了20倍。scRNA-seq的结果中一个细胞类群主要由人为解离诱导的应激反应基因组成，而snRNA-seq中没有检测到这种细胞类群。针对于检测基因灵敏度的问题，两种方法相当。（图4）
图4 肾组织中的scRNA-seq与snRNA-seq比较
针对肿瘤样本，2020年来自MIT的课题组在Nature Medicine中发表了一篇文章，对不同肿瘤类型的新鲜/冷冻样本进行scRNA-seq和snRNA-seq，测试不同的实验方法，以及来自同一肿瘤样本的新鲜和冷冻状态的比较，并根据细胞/核质量、数据恢复的细胞数与预期的细胞/核数量、细胞组成等指标对测序结果进行评估。作者将scRNA-seq和snRNA-seq针对同一肿瘤类型的结果进行对比分析。结果显示两种方法检测到的细胞类型相似，但比例差别较大。例如，在神经母细胞瘤中，免疫细胞在scRNA-Seq中比例更高，神经嵴、神经内分泌细胞等实质细胞大幅减少；snRNA-Seq结果中实质性细胞（特别是恶性细胞）比例更高，而T细胞大幅减少，B细胞和NK细胞基本消失，内皮细胞、上皮细胞增加。同时，解离信号在scRNA-seq中的检出率远高于snRNA-seq，尤其是在免疫细胞如T、NK、巨噬细胞等和基质细胞如成纤维细胞和内皮细胞中更为突出，这有可能是实质细胞解离损伤释放的信号所致，也有可能是免疫激活和早期反应的信号。
图5 肿瘤样本中不同测序方法的比较
同样在脑组织中，scRNA-seq得到的神经元细胞大大少于snRNA-seq。
图6 脑组织中两种方法的比较
除了细胞比例的不同，如果将两种方法得到的reads比较，会发现snRNA-seq得到比对结果中intron的reads比例会明显比scRNA-seq中增加（图8）。因此在数据分析时，需要将intron数据也包含在分析结果里。
图7 ntron reads 比例的比较
总结
单细胞核测序相对单细胞测序在样本的适用性上更具优势：从样本类型上看，它不局限于新鲜样本，也适用于冷冻样本和一些难解离的样本。从细胞分群结果上来看，可以减少酶解、机械压力诱导的假细胞类群的产生，且针对在解离时容易死亡的细胞，用细胞核测序的方法可以进行检测。
但细胞提核做RNA测序就完全可以取代单细胞RNA测序吗？答案显然是否定的。单细胞核中RNA数量还是明显低于整个细胞测序得到的分子数，而且从上述比较中可以看出，单细胞核测序可能不适用于关注免疫细胞的研究。另外，就经验来看，提核测序还是存在相当的风险。不同的组织提核的条件需要摸索，而新鲜和冷冻组织也需要用不同方法提核，以便于在保证核膜完整的情况下尽量去除细胞碎片和杂质。我们可以通过在显微镜下直接观察核膜完整性与形状以及背景复杂程度来判断提核的质量，或者也可以通过流式筛选的方式来将核分离出来。但以上方法均无法判断核内RNA完整性与降解程度，尤其是对于冷冻样本，在冷冻前样本的保存情况以及冷冻方法也对核内RNA的降解情况有非常大的影响。
总而言之，单细胞测序与单细胞核测序两种方法各有优势，我们需要根据自己的样本类型、感兴趣的细胞亚群等条件选择合适的方法。
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