单细胞转录组测序（scRNA-Seq）已成为目前最炙手可热的科研技术之一，在揭示细胞间状态、转变和细胞间差异表达中有重要的意义。目前已广泛应用于肿瘤、神经、发育等领域。
2021 年 1 月，上海长海医院任善成教授与加拿大多伦多大学 Housheng Hansen He 教授、复旦大学附属肿瘤医院王建华教授合作在 Nature Cell Biology 杂志发表了题为「Single-cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression」论文。
（图片来源：Nature Cell Biology）
文章通过单细胞转录组测序技术，解析了前列腺癌肿瘤微环境的高度异质性，发现了临床病理和影像学无法识别的微转移灶，还揭示了癌细胞通过外泌体的方式驯化免疫细胞转录组使其表达肿瘤基因，这些都对前列腺癌治疗靶点的确定和侵袭性肿瘤生物标志物的研发开拓了思路。
下文主要针对单细胞测序如何应用于肿瘤研究，如何设计实验样本、分析研究数据等问题进行解析。
文章概览
研究结果展示
通过对 Batch1 进行单细胞转录组测序，注释细胞类型主要包括上皮细胞、单核-巨噬细胞系、T 细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞等主要群体。然后分别对每个大群进一步分析。
Fig.1 13 例前列腺癌样本的单细胞研究概况
（图片来源：Nature Cell Biology）
1. 与肿瘤预后相关的上皮细胞类型
通过拷贝数变异分析、肿瘤细胞的 marker 基因/信号通路相关性分析，将上皮细胞鉴定为 luminal types、cell-cycle 、basal/intermediate 类型；我们主要研究了这些细胞类型与临床预后的关系，发现特异性表达细胞因子 CCL2 的 basal/int. 亚群与前列腺癌有较好的预后关系；而 cell-cycle 细胞亚群则与前列腺癌预后呈负相关。
Fig.2 上皮细胞与 maker 基因相关性打分情况
（图片来源：Nature Cell Biology）
Fig.3 TCGA 预后关联性分析
（图片来源：Nature Cell Biology）
2. 单细胞测序发现肿瘤转移潜在机制和微转移灶
在 T 细胞的研究中，我们惊奇的发现，T 细胞竟然表达前列腺癌特异性基因 KLK3，深入挖掘分析多种类型的单细胞公共数据库发现 T 细胞均表达相应的肿瘤标记基因的广泛特征。
接下来，以 KLK3 为中心，进行了基因与亚群功能相关性分析、基因共表达网络分析，发现 KLK3 与细胞外囊泡（EV）和外泌体 PSA 相关通路被激活，这提示我们肿瘤可能通过分泌 EV 介导 KLK3 转移至 T 细胞并降低其杀伤功能，为了证明该途径的可行性，我们反复通过流式分选、RNA 荧光原位杂交、免疫组化等验证实验，发现了表达 PSA/KLK3 的 T 细胞，进一步证实肿瘤细胞通过外泌体驯化 T 细胞使其表达与肿瘤转移相关的肿瘤标记基因。
Fig.4 T 细胞表达前列腺癌特异性抗原 PSA
（图片来源：Nature Cell Biology）
那 EV 转移是否会影响附近淋巴结（LNs）以及影响程度如何呢？我们又设计了前列腺癌淋巴结转移样本（Batch2）进行单细胞测序，同样地发现所有肿瘤样本的 T 细胞普遍高表达 KLK3。
有趣的是，其中一例前列腺癌患者的 MRI 影像及术后病理均提示左右两侧髂外淋巴结为阴性，而 scRNA-Seq 细胞亚群统计显示右侧淋巴结组织中存在高表达 KLK3 的 T 细胞，提示这可能已经形成了「转移前癌巢」结构；而左侧淋巴结组织中不仅存在高表达 KLK3 的 T 细胞，还存在恶性上皮细胞，即左侧淋巴结已发生了临床无法识别的微转移灶。
除了这一发现，我们还注意到 Batch2 样本采用 BD Rhapsody 平台进行单细胞分选时，我们分析存在一群中性粒细胞，而 Batch1 样本采用 10X Genomics 分选平台的数据中没有分析到中性粒细胞的存在。
Fig.5 单细胞测序发现临床和影像学无法识别的微转移灶
（图片来源：Nature Cell Biology）
3. 基质细胞的分析模式
我们从 signature 基因、pathway 和转录因子等多角度完整描述了基质细胞的高度异质性，并在内皮细胞（EC）中发现有一部分高表达肿瘤相关性成纤维细胞（CAF）的相关特征基因，将其命名为激活的内皮细胞（aECs）。通过细胞通讯分析，发现 aEC 与上皮细胞有强作用关系，提示其可能影响肿瘤的进展。
Fig.6 aEC 与上皮细胞有强作用关系
（图片来源：Nature Cell Biology）
于是，重新设计 11 例不同时期前列腺癌样本（Batch3），分选出内皮细胞进行单细胞测序，通过拟时序分析发现 aEC 细胞大部分均来源于 CRPC 样本，其亚群占比随肿瘤进展至 CRPC 而逐步升高，表明 aEC 细胞亚群与前列腺癌恶性进展为 CRPC 密切相关。
我们利用流式分选，证明了大部分 aEC 细胞亚群来自于 CRPC 样本；通过共培养发现 aEC 细胞亚群能够提高前列腺癌细胞的侵袭能力，这些实验都证实了 aEC 这一细胞亚群在前列腺癌发生发展过程中起着重要的作用。
Fig.7 aEC 占比与前列腺癌恶性进展密切相关
（图片来源：Nature Cell Biology）
总结
我们通过巧妙地实验样本设计、深入地 scRNA-Seq 数据分析和验证实验，阐述了前列腺癌淋巴结转移的潜在分子机制，并发现了一群与肿瘤进展相关的新细胞亚型，对前列腺癌新型治疗策略和预后指导具有重要意义。
