哺乳动物的大脑皮层具有着无与伦比的细胞类型多样性，为了维持皮质正常的分层与行使功能，这些细胞类型是在一系列严格约束下产生的；此外，随着皮质的发育，大量细胞还会经历细胞状态的转换。因此，研究支配皮质细胞类型的产生和组织的分子机制存在难度。本研究中，作者采用单细胞RNA测序、单细胞ATAC测序以及空间转录组技术，单细胞多组学的结合生成了发育中的小鼠新皮质的综合图谱，绘制了整个小鼠皮质发生过程中所有细胞类型的发育轨迹，确定了伴随个体细胞类型谱系规范的纵向分子动力学，从而能够对异常皮质发生的机制进行探索。
结 果
1.综合图谱绘制
小鼠整个皮质发生期包括：对称分裂的神经上皮细胞阶段(E10.5和E11.5)、生第6层和第5层兴奋性神经元产生阶段(E12.5和E13.5)、第4层和2/3兴奋性神经元产生阶段(E14.5至E17.5)、胶质生成阶段(E18.5至出生后第1天和第4天)(图1a)。因此研究者在以上每个时间点取了皮质样本，进行单细胞RNA测序，总共获得了98,047个单细胞数据，注释出了现已知的发育中大脑皮层所有细胞类型(图1b)。 皮质发育最早阶段主要由顶端祖细胞(AP)和中间祖细胞(IP)组成(图1b)。从E12.5开始，祖细胞发育成含投射神经元(PN)的连续分层，包括皮质投射神经元(CFuPN)和胼胝体投射神经元(CPN)，该结果与之前的报道一致(图1b、c)。从 E13.5 开始出现腹侧产生的抑制性中间神经元(图1b-d)，如内侧神经节隆起(MGE)衍生的中间神经元和尾神经节隆起(CGE)衍生的中间神经元。此外，本研究首次在E17.5 观察到少突胶质细胞前体细胞和星形胶质细胞的产生，还鉴定出了小胶质细胞、红细胞、内皮细胞、周细胞以及血管和软脑膜细胞(图1b、c)。 综上，单细胞RNA测序结果突出了从 AP 到 PN 和神经胶质细胞的主要分化轨迹，且非皮质来源的细胞(中间神经元、小胶质细胞、脉管系统和脑膜)被排除在轨迹之外。正如预期的那样，首先在 E11.5 检测到 Cajal-Retzius 细胞，它们来自于表达 Wnt8b 的内侧祖细胞(图1d)。
图1 小鼠皮层发育的综合图谱
2.动态细胞状态的空间图谱
为了获得细胞类型的空间位置，研究者收集了E12.5、E13.5、E15.5 和 P1 的冠状脑切片进行空间转录组测序，并将scRNA-seq 图谱的细胞类型映射到相应发育阶段。结果显示，每种细胞类型的空间分布结果与其预期位置一致(图2a)。scRNA-seq 图谱中确定的5种深层神经元亚型：皮质丘脑和大脑下PN(CThPN 和 SCPN)、第5和6层CPN、第6b层神经元和推定的近投射Tshz2 阳性神经元，空间转录组早在P1时就将这5种细胞类型映射到特定位置。空间转录组技术还定位了瞬态细胞状态，例如神经元可径向迁移穿过脑室下区和中间区。研究者将E15.5 兴奋性迁移神经元和未成熟神经元重新聚类细分为五个亚群，映射到空间转录组数据中显示了连续的顶端到远端分布(图 2b)。单细胞图谱也显示相同的顺序(图2b，左)，表明了基因表达的时空梯度。
图2 皮层发育过程中细胞类型空间分布
3.新皮质细胞分化轨迹
为了研究细胞分化的连续轨迹，研究者聚焦于scRNA-seq图谱，利用皮质来源的细胞进行拟时轨迹分析，并生成基于URD算法的轨迹树(图3a)。由此产生的分支树可以准确反映了分化状态、年龄和marker表达(图3a)。Monocle3分析也得到了类似的结果，但基于其他轨迹算法的结果与既往报道的生物学知识不太一致。URD分析表明神经元多样化和层次发生在有丝分裂之后(图 1d、3a)。接着，URD轨迹树还绘制了神经元和神经胶质类的分化轨迹上不同的转录变化。神经元轨迹的早期共享部分显示细胞周期相关基因 (Gadd45g)的下调、神经发生(Neurog2)和迁移相关基因(Sstr2、Neurod1)的瞬时表达以及泛神经元基因(Neurod2，Tubb3)的上调(图3b)。与单个基因相比，基因模块的联合分析可以更强有力地描述多样化等复杂的生物过程。因此，研究者通过非负矩阵分解(NMF)确定每个时间点的基因模块，使用排名靠前的基因对其进行注释，并从连续时间点链接模块以定义皮质发生不同方面的“遗传程序”(图3c)。尽管一些模块与广泛的发育过程有关，但神经元谱系特异性程序在 E13.5 时已可区别，支持了在有丝分裂后发散的共享发育轨迹(图3c)。
研究者建立的轨迹树可用于识别与谱系分叉点相关的基因，并在每个分支点分析父分支和子分支之间的差异基因表达，为每个基因评估重要性分数。对于大多数分支点，得分最高的基因富含DNA结合蛋白，但随着分化过程推进，细胞粘附和细胞骨架相关蛋白变得更加突出，反映了发育形态变化。每个子分支的TOP转录因子(TF)和DNA结合蛋白包括已知控制细胞类型的TF(例如 Bcl11b、Fezf2、Satb2)和新的候选调节因子(图3d)。总之，这些数据提供了与细胞类型差异相关的基因，这些基因是未来功能研究的候选基因。
图3 新皮质细胞类型的发育轨迹
4.表观基因组与转录组的一致性
为了研究表观遗传调控是否显示出相似的轨迹，研究者又在 E13.5、E15.5 和 E18.5 分析单细胞的染色质可及性(scATAC-seq)，推断基因的活性，也确定皮质细胞的种类，并与之前的报告一致。接着将scATAC-seq和scRNA-seq数据整合，两种测序数据在降维图上的重叠，说明了scATAC-seq在捕获细胞类型上是与scRNA-seq数据一致(图4a，底部)。其次，研究者使用 scATAC-seq 的基因活性来构建皮质细胞的发育轨迹树，可以根据取样时间和细胞分化状态进行拟时间排列(图4b、c)，这结果与包含相同三个时间点的scRNA-seq的轨迹树相当(图4d)。值得注意的是，近投影神经元是唯一分配给树中不同分支的群体(比较图4b 和图3a)，这表明这些神经元可能与CFuPN 和深层CPN相关。此外，一些基因的染色质可及性先于基因表达，这表明表观遗传谱系的启动(图4e、f)。
图4 发育中皮层的scATAC-seq图谱
5.Fezf2调控CFuPN和CPN分化命运
为了阐明皮质发生功能丧失小鼠模型的表型变化，研究者接着测试了构建的发育图谱可用性。因为Fezf2的缺失会导致SCPN的完全丧失，所以研究者利用Fezf2突变体研究SCPN丢失的机制，以及在丢失位置新产生的神经元类型，目前研究对这些信息仍然知之甚少。通过收集E15.5和P1的Fezf2突变小鼠和正常对照小鼠的发育皮层进行scRNA-seq，分别获得了16,117个突变细胞数据和 17,344个正常细胞数据；再应用 NMF 基因模块分析，发现SCPN和CThPN的模块中，Fezf2是排名靠前的基因(图 5a)，且这些模块基因中约有 70%是在敲除组中被特异性下调的(图 5b)。然而，在Fezf2敲除组中唯一显着上调的基因模块与任何E15.5野生型模块都不匹配。这种敲除特异性模块富含轴突发育和引导基因，与突变细胞中的异常轴突投影一致。 在Fezf2敲除小鼠中，深层神经元SCPN和CThPN被基因敲除特异性群体取代(图5c、d)。研究者应用随机森林分类器定义这些特异性群体的类型，结果显示大多数敲除细胞被分配到 CThPN或第5&6层CPN(图5e)。尽管在E15.5时，有22%的特异性细胞被定义为SCPN，但在 P1时只有1% ，这表明无论Fezf2的表达与否，皮层内瞬时激活了CFuPN向SCPN分化程序。敲除特异性CThPN样细胞上调CPN的基因，敲除特异性 CPN样细胞与对照组深层CPN和SCPN明显不同。此外，Fezf2的缺失会上调CThPN中的CPN基因，并导致SCPN被类似于但不同于第5和6层CPN的细胞取代。这些结果表明，在CFuPN分化过程中，Fezf2的存在可以抑制了CPN基因模块，异常细胞群并不是停滞在未成熟阶段的细胞，而是与内源性细胞不同的细胞类型。 最后，对E13.5对照和敲除组皮层的单细胞分析没有发现细胞类型组成的重大差异，只有有丝分裂后神经元表现出转录差异，其表型与后期时间点的表型相似。因此，虽然Fezf2在祖细胞中表达，但它在SCPN规范中的作用似乎主要是有丝分裂后。这支持研究者的发现，即神经元亚型细胞是在有丝分裂后受到限制。
图5 Fezf2 抑制CFuPN获得胼胝体(CPN)表型
结 论
研究者在整个胚胎皮质发生和产后早期对新皮质进行采样，联合使用单细胞转录组测序、空间转录组测序和单细胞染色质可及性分析，绘制了皮质发育的图谱，重建了皮质细胞类别多样性的发育轨迹，推断了它们的空间组织和伴随其谱系分叉决策和分化轨迹的基因调控程序。最后再次利用单细胞转录组测序，展示了该发育轨迹如何应用于皮质发生异常相关的细胞起源。总之，这些单细胞数据提供了新皮层细胞多样化的调节机制全局图景。
参 考 文 献
Di Bella, D.J., Habibi, E., Stickels, R.R. et al. Molecular logic of cellular diversification in the mouse cerebral cortex. Nature (2021).
