01
CUT&Tag技术发展历程
ChIP-Seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）因能真实、完整地反映靶蛋白与DNA序列的结合情况，因而成为研究DNA-蛋白相互作用的经典方法。但ChIP-Seq继承了ChIP的难点与局限性：需要大量细胞投入（106-107），甲醛交联易导致假阳性或假阴性，对染色质的完整性、免疫沉淀抗体的特异性较为敏感，整体实验步骤复杂耗时长，测序数据背景信号高等，这些难点使得低投入量、低丰度的靶蛋白、弱结合DNA-蛋白质的研究变得较为困难。
针对ChIP-Seq的局限性，2004年Manfred Schmid等开发出染色质内源切割ChEC（chromatin endogenous cleavage）和染色质免疫切割ChIC （chromatin immunocleavage）这两种技术（Schmid et al., 2004）。ChEC技术需要在待研究的目的蛋白C端加上MNase构成融合蛋白重组体。ChIC技术通过抗体识别感兴趣的蛋白，利用proteinA和MNase的融合蛋白pA-MN与抗体结合来进行DNA切割（加入Ca2 后激活），从而避免了构建重组体，但CHIC应用于固定后的酵母细胞的细胞核，甲醛固定带来的问题并未解决。
2017年，美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队基于ChIC技术开发了CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）技术，其主要原理是：细胞经过洋地黄皂苷（digitonin）透化处理后与目标抗体孵育，抗体进入细胞与目的蛋白结合；细胞再与proteinA/G-MNase孵育，加入Ca2 激活MNase，切割目的蛋白结合位点附近的染色质，被切割下来的片段扩散到上清中，从上清液中收集DNA片段，经过常规DNA建库步骤进行建库，文库上机测序（见图1）。
图1.CUT&RUN实验流程图 (Skene et al., 2018)。
2019年，Steven Henikoff团队使用pA-Tn5替代pA-MNase，推出了CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术。其原理与CUT&RUN类似，首先通过刀豆蛋白A包被的磁珠（ConA beads）吸附细胞（与细胞膜上的糖蛋白结合），通过洋地黄皂苷在细胞膜上“打孔”，在抗体引导下，转座酶精准靶向目的蛋白。与MNase不同的是，转座酶对目的蛋白附近的DNA进行片段化的同时会加上二代测序所需的部分接头序列，经过PCR扩增即可获得直接用于测序的文库。相较于ChIP-Seq技术，CUT&Tag无需交联，所需的细胞起始量低、操作简单、实验周期短、数据信噪比高、重复性好，为极低样本投入量和单细胞测序研究提供了可能性。
图2.CUT&Tag实验流程图。
02
CUT&Tag数据展示
Henikoff等通过传统ChIP-Seq、CUT&RUN、CUT&Tag三种方法对K562细胞中组蛋白修饰H3K27me3进行研究，结果显示，在相同的数据量（8M Reads）情况下，三种方法的染色质景观相似，但ChIP-Seq的背景较高，50M Reads的 ChIP-Seq才能得到与8M Reads CUT&Tag相当的染色质景观。总的来说，CUT&Tag的背景低，信噪比更高。
图3.CUT&Tag测序数据染色质景观（Kaya-Okur et al., 2019）。
03
相关案例分析
2020年1月，北京大学系统生物医学研究所尹玉新课题组在国际免疫学领域顶级期刊Nature immunology发表了题为“The phosphatase PAC1 acts as a T cell suppressor and attenuates host antitumor immunity”的研究论文，揭示了磷酸酶PAC1作为T淋巴细胞功能抑制因子，可以减弱宿主细胞免疫监视功能，促进肿瘤免疫逃逸的作用机制。在这篇文章中，研究人员利用ATAC-seq技术（Vazyme #TD501）研究染色质开放性，发现PAC1的缺失增加了染色质开放性，利用CUT&Tag技术（Vazyme #S603）进一步研究了NuRD复合体的核心成分CHD4与DNA的结合谱。
2020年10月，清华大学颉伟课题组在顶级期刊Nature上发表题为“The landscape of RNA Pol II binding reveals a stepwise transition during ZGA”的研究论文。在该研究中，与南京诺唯赞生物科技股份有限公司（Vazyme Biotech）合作，开发了高灵敏度检测蛋白和DNA在全基因组相互作用的方法——Stacc-seq，实现了在少量细胞水平上进行Pol II的检测，揭示小鼠早期胚胎中RNA聚合酶II通过“三步走”的模式参与实现基因组激活。
由于植物存在细胞壁、大液泡以及复杂次生代谢产物，植物组织中CUT&Tag的应用非常具有挑战性。2020年9月，浙江大学农学院的关雪莹课题组以棉花为模型系统，开发了在植物中分离细胞核后进行CUT&Tag实验的方法。研究结果表明，与常规ChIP-Seq相比，CUT&Tag显示出更高的分辨率，更低的背景信号和更好的重复性，为植物中染色质状态的表观遗传研究提供了一个新方法，相关研究成果以“Efficient Chromatin Profiling of H3K4me3 Modification in Cotton Using CUT&Tag”为题发表在Plant Methods上。2021年4月，华中农业大学李兴旺课题组将CUT&Tag技术应用于单子叶植物水稻和双子叶植物油菜籽上，新鲜或交联组织都可提核后进行CUT&Tag实验，可以使用低至0.01g植物组织作为起始材料，一天即可完成实验，相关研究成果以“Rapid and Low-Input Profiling of Histone Marks in Plants Using Nucleus CUT&Tag”为题发表在Frontiers in Plant Science上。
04
CUT&Tag在单细胞上的应用
CUT&Tag需要的细胞起始投入量低，使用试剂盒可以进行低至60个细胞的实验，这是传统的需要百万级细胞起始量的ChIP-Seq所不能及的。2019年，Henikoff团队将CUT&Tag实验首次应用于单细胞，将大量的K562细胞进行CUT&Tag实验，Tn5切割后，通过Takara ICELL8单细胞分离系统把单个细胞分配到5184 纳米孔中，再加入一组带随机标签的引物进行扩增，实现单细胞测序。2021年4月，美国华盛顿大学Anoop P. Patel团队和美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队合作，将单细胞分离平台（ICELL8 或10× Genomics）与CUT&Tag技术结合，描绘来自复杂组织和人类胚胎干细胞分化过程中的单细胞的染色质分布，该研究发表在Nature Biotechnology上。在这篇文章中，研究人员分析了在单个细胞中H3K27me3标记的多梳家族（Polycomb group, PcG）区域，作为染色质可及性的正交方法来鉴定细胞状态。结果显示，针对H3K27me3的scCUT＆Tag分析可区分人血液中的细胞类型，并允许从异质性组织生成不同细胞类型的PcG图谱。
此外，通过scCUT＆Tag对治疗前后脑肿瘤患者的H3K27me3进行分析，研究人员鉴定了肿瘤微环境中的细胞类型以及治疗前后PcG活性的异质性。在同期发表在Nature Biotechnology的研究中，瑞典Karolinska学院Gonçalo Castelo-Branco、Marek Bartosovic等研究人员合作发现，将单细胞分离平台（10× Genomics）与CUT&Tag技术结合，可以分析复杂组织中的组蛋白修饰和转录因子情况。研究人员在小鼠中枢神经系统中的大量细胞上应用单细胞CUT&Tag (scCUT&Tag)，探测活跃启动子区域、增强子、转录区域（H3K4me3、H3K27ac和H3K36me3）和非活跃区域（H3K27me3）的组蛋白修饰特征。未来，CUT&Tag在单细胞上的应用一定越来越广泛。
图4.CUT&Tag在单细胞上的应用
（上图（Wu et al., 2021）；下图（Bartosovic et al., 2021））。
参考文献
1.Bartosovic, M., Kabbe, M., and Castelo-Branco, G. (2021). Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nat Biotechnol 39, 825-835.
2.Kaya-Okur, H.S., Wu, S.J., Codomo, C.A., Pledger, E.S., Bryson, T.D., Henikoff, J.G., Ahmad, K., and Henikoff, S. (2019). CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun 10, 1930.
3.Schmid, M., Durussel, T., and Laemmli, U.K. (2004). ChIC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Mol Cell 16, 147-157.
4.Skene, P.J., Henikoff, J.G., and Henikoff, S. (2018). Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc 13, 1006-1019.
5.Wu, S.J., Furlan, S.N., Mihalas, A.B., Kaya-Okur, H.S., Feroze, A.H., Emerson, S.N., Zheng, Y., Carson, K., Cimino, P.J., Keene, C.D., et al. (2021). Single-cell CUT&Tag analysis of chromatin modifications in differentiation and tumor progression. Nat Biotechnol 39, 819-824.
