一、比对参考基因组还是参考基因集
为了获取表达矩阵，可以将测序数据比对到参考基因组然后通过坐标文件 GTF（GFF 或者 BED）统计每个基因比对上的数据计算丰度，或者直接与参考基因集进行比对，直接计算每个基因覆盖深度的方法。但是两种方法之间有较大的差别：
第一：基因集中不能保证所有基因都是准确的，例如一个基因预测结果不准确，比真实情况过长，那么长度来的部分则没有序列覆盖到；
第二：基因集都是已知的基因，一些没有预测到的基因无法比对上，丢失了这部分信息，利用全基因组比对，可以对已知基因进行纠正；
第三：基因集中不包括可变剪切的信息，而与全基因组序列比对，然后综合GTF 文件中已知转录本信息，则可以找到一些新的转录本；
第四：全基因组有更长的序列，因此 reads 比对过程中更容易比对上，基因长度过短，头尾部不容易比对上，这样就会对最终计数产生影响。
二、基因水平差异还是转录本水平差异？
真核生物由于可变剪切的存在，同一个基因通过外显子的不同组合，会表达出不同的转录本，最终翻译出不同的蛋白质序列。那么对于 RNAseq 研究，是在基因水平还是转录本水平比较差异更准确呢？
严格来说，应该比较转录本水平的表达差异更加准确。但由于目前测序读长过短，假设有来自同一基因的三个转录本 A，B，C，长度分别是 1000bp，800bp，600bp，假设测序读长 2*100bp，最终测序出来的 reads 无法准确分配给最终的转录本 A，B 或者 C，并且还可能存在新的转录本 D，因此，当前条件下采用基因水平的差异表达计算。
目前开发出一些工具可以用户转录本水平的定量，例如 RSEM 工具。
三、几种 RNAseq 定量方法比较
给定两个基因，如何比较是否存在表达差异呢？如何进行量化。由于来自不同样品，并非测序全长，测序深度不同，可变剪切等因素的影响，不能直接比较覆盖 reads 数，因此需要进行均一化。由于我们通常对同一个基因进行差异表达的比较，因此，均一化的主要作用是消除测序深度的影响。目前采用的主要方法是 RPKM，FPKM，TPM，CPM 等方法，每一种方法都不是完美的，都有其特定的使用范围。
无论采用哪种比较方法，我们都应该知道下面两个原则：
1、RNAseq 定量都是一种相对定量的方法，不同的定量方法，结果会有所差异；
2、一般研究只关注差异最大的一些基因，因此，无论采用哪种定量方法，差别最显著的都会凸显出来。
代码语言：javascript复制https://www.reneshbedre.com/blog/expression_units.html3.1 reads count
测序完成之后，每一个基因被测序到的 reads 数目，理论上来说，基因表达量越大，基因长度越长，测序深度越大，被测序到的 reads 数目越多。
不同基因比对得到的 Read 个数
注意事项：由于可变剪切的存在，计算 reads counts 可以相对于基因，也可以相对于转录本，如果是相对于转录本就比较复杂，存在多重比对的情况。
3.2 RPKM
RPKM 全称是（Reads Per Kb per Million reads）（Mortazavi, 2008），
其计算公式为：
nr 是比对至目标基因的 read 数量；
L 是目标基因的外显子长度之和除以 1000
N 是全部 reads 数目
不同基因的 RPKM 值的计算结果（“M”为 100 时）
3.3 FPKM
FPKM：FPKM（Fragments PerKilobase Million），FPKM 和 RPKM 的计算方法基本一致，只不过把 reads 换成了 Fragments。
nf 是比对至目标基因的 fregment 数量
对于单末端测序数据，由于 Cufflinks 软件计算的时候是将一个 read 当做一个fragment 来算的，故而 FPKM 等同于 RPKM。对于双末端测序，如果一对paired-read 都比对上了，那么这一对 paired-read 称之为一个 fragment；而如果只有一个比对上了，另外一个没有比对上，那么就将这个比对上的 read 称为一个 fragment。而计算 RPKM 时，一对 paired-read 会当成两个 read 分别计算。
3.4 TPM
TPM（Transcripts PerKilobase Million）计算公式：
下面是依照公式计算上表中基因的 TPM 值（注意：为了便于显示，同上，将公式中的 100 万改为 100）：
不同基因的 TPM 值的计算结果（“M”为 100 时）
3.5 CPM
CPM（counts per million),在 edgeR 中，提供了一种名为 CPM 的定量方式，全称为 count-per-millon。
假定原始的表达量矩阵为 count, 计算 CPM 的代码如下
cpm <- apply(count ,2, function(x) { x/sum(x)*1000000 })
原始的表达量除以该样本表达量的总和，在乘以一百万就得到了 CPM 值 。从公式可以看出， CPM 其实就是相对丰度，只不过考虑到测序的 reads 总量很多，所以总的 reads 数目以百万为单位。
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