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二、常见问题
2.1 为什么不做单细胞 DNA 测序？
首先，同一个体绝大部分细胞 DNA 是相同的，即使是肿瘤也只是微小突变，而不同细胞在转录水平有很大差别；
其次，如果要对 DNA 进行测序，数据量非常大，不划算。现有的单细胞 DNA 测序主要是用来检测 200K 以上的 CNV 拷贝数变异。
2.2 单细胞测序与三代测序结合？
目前主流的单细胞测序主要采用二代测序，主要原因是因为单细胞测序数据量巨大，二代测序比较价格更低，而且主要用于计数，对片段长度要求并不高。
不过也可以进行单细胞与长读长进行测序。这就需要在捕获完单细胞之后，采用三代测序的建库方法。
2.3 原核生物是否可以做单细胞测序？
单细胞测序需要通过 polyA 进行 mRNA 捕获，原核生物不具有 polyA 尾巴，目前无法进行单细胞测序；
2.4 植物可以做单细胞测序吗？
可以，但是植物由于具有细胞壁，在制作单细胞悬液的时候与动物细胞不同。
2.5 单细胞测序数据量
单细胞测序数据量与细胞数目正相关，假设测序 5000 个细胞，每个细胞测序 5 万条数据，根据测序文库我们可以计算 reads 长度，假设采用 v3 试剂，reads 总长度为 28bp 91bp，总长为 119bp。那么数据量则为 5000*50000*119=29,750,000,000bp，约等于 30G 数据，这还不包括其他 reads ID 与质量值信息。
2.6 测序饱和度
通过bulk RNAseq测序我们知道，如果想要对RNAseq测序达到饱和，至少需要20M条reads，而单细胞测序每个细胞几万条 reads，远远没有达到饱和。这是因为如果每个细胞都测序达到饱和，那么数据量将惊人，假设一个细胞 2G 数据，5000 个细胞的数据量也特别大,10个T数据。
虽然单个细胞没有达到饱和，但是单细胞测序会测序很多细胞，相当于每个细胞都有很多重复对照，假设每个细胞测序 50K 数据，该亚群中包含 400 个细胞，则数据量得到了 20M。从整个细胞群体的角度来说，已经达到了饱和。
有文献进行测试发现，每个细胞测序 2~3k reads，也可以得到很好的分群准确性。
2.7 单细胞测序是否需要对照组？
单细胞测序一般不需要对照组，因为单细胞测序的主要目的是为了鉴定整个组织的细胞类型。而非不同样品之间表达差异比较。通过组织内部不同组之间比较差异表达基因即可。单细胞差异表达基因为一个亚群相比于其他亚群的差异，而并不是两组之间比较。
2.8 单细胞测序是否需要加入内参？
单细胞测序一般不需要内参，首先，建库已经 GEM 内部完成，不容易混合，其次，单细胞测序通过 umi，可以准确鉴定表达的 reads 数目，接近于绝对定量，不需要加入内参，而且内参价格较贵，可以节省成本。
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