一、RNAseq简介
1.1 RNAseq 定义
转录组，也叫做 RNAseq，是指特定类型细胞中全体转录本的集合。在转录组中，既包括编码蛋白的信使 RNA(mRNA),也包括不编码蛋白的 rRNA，tRNA，小RNA，lncRNA 等非编码 RNA。这些 RNA 转录本彼此协同作用，共同来调控细胞的生长，发育，凋亡等一系列重要的生理过程。对于转录本的研究通常包括定性和定量两个方面。
转录组是细胞特定时刻基因表达谱的一个快照，它其实是一个动态的过程，DNA是静态的过程，我们测序只是捕获某一状态下的情况。对于转录组的测序就称为 RNAseq。
1.2 mRNAseq
我们目前的 RNAseq 测序主要就是研究转录出来的 mRNA。关于转录我们都了解中心法则，中心法则的主要内容是，DNA 转录成信使 RNA，然后以这个 mRNA 作为模板，翻译成氨基酸，mRNA 也能反转录成 cDNA。
通过高通量测序，我们验证了中心法则是正确的。但细胞内真实的转录情况要比这个复杂的多。也就是一次转录过程，除了有信使 RNA，核糖体 RNA，转运RNA 之外，还有很多其他的 RNA。种类远远不止 mRNA，tRNA 和 rRNA。我们把mRNA 称为 coding RNA，编码 RNA，也就是和最终的氨基酸相关，而其余所有转录出来的 RNA 都称为 ncRNA，就是非编码 RNA。这就拓宽了我们之前的认识，这么多非编码 RNA，很多都是基因组上非基因组转录出来的。
1.3 非编码 RNAseq
当前转录组研究包括，mRNA，长链非编码RNA，小RNA，环状RNA 等。
一次转录过程中，不同 RNA 含量（https://www.frontiersin.org/arti ... ene.2015.00002/full）
上表中列出了细胞一次转录过程中，各种 RNA 的含量。每一次转录过程中各种 RNA 的比例也是不同的，因为转录是一个动态的过程，这里列出了各种 RNA 含量的大致分布，核糖体 rRNA 占据了 80%以上，tRNA 占了 14%——15%左右，而 mRNA 占据 4-5%，其余其他的RNA 占了不到 1%。而原核生物与之类似，rRNA 占据 80%左右，tRNA 占据 15 左右，而 mRNA和其余各种非编码 RNA 占据约 5%。
所以，我们看到在一次转录过程中，rRNA 和 tRNA 就占据了 95%左右，占据了很大的比重，而 mRNA 只占据不到 5%。在 RNAseq 测序中，我们需要的恰恰就是这 5%的区域。
除了传统的 mRNAseq 测序，目前又逐渐开发除了其他非编码 RNA 的测序，包括长链非编码RNA（LncRNA） 测序，小 RNA （Small RNA），环状 RNA（circRNA）以及全转录组测序，单细胞转录组测序，转录调控因子测序，蛋白质组学测序，代谢组学测序等。
二、RNAseq 研究 10 年
地址：https://www.nature.com/articles/s41576-019-0150-2
三、分析内容
3.1 差异表达基因
差异表达基因（DGE, differential gene expression）是通过比较处理组与对照组之间相同基因在不同条件下的表达情况。差异表达基因 DGE 是目前 RNAseq的主要分析内容。
3.2 差异表达基因注释
得到差异表达基因之后，将差异表达基因集进行功能注释以及富集，例如 GO 功能注释，KEGG 功能注释等。
3.3 可变剪切
可变剪切是指 mRNA 前体通过不同的剪接方式产生不同的 mRNA 剪接异构体，从而使一个基因产生多个不同的 mRNA 转录本，进而能够翻译成多种不同的蛋白。可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要原因，是真核生物转录组复杂性和多样性的重要原因。
可变剪切的发生是通过剪接体（spliceosome）识别 mRNA 前体中内含子与外显子连接边界的剪接位点，通常是保守的二碱基序列 GT-AG。一个 mRNA 前体通常含有多个剪接位点，从而产生多条可变剪切异构体，编码多个具有不同功能的蛋白。
根据剪接位点位置的不同，可变剪切可以分为以下 5 种类型：
可变剪切示意图
ES：外显子跳跃
A3SS：3’端可变剪切
A5SS：5’端可变剪切
MEX：外显子选择性跳跃
IR：内含子保留
还有一些软件将可变剪切事件分为 7 种类型，加上可变的起始或末端外显子（Alternative first/last exon），这两种形式更有可能是可变启动子、可变polyA 位点形成的。
3.4 新转录本识别
新转录本是相对于原有的转录本来说的， 原有的转录本就是参考序列中列出的已知的转录本，也就是我们下载参考序列的 GTF 或者 BED 文件，这些文件中存储了转录本的信息。与这些已有的信息相比，GTF 中不包含的转录本就是新转录本。那么为什么会有新转录本呢。主要有以下几个原因。
第一，是原有的基因预测不准确，在对全基因组 DNA 进行基因预测的时候有误差，比如一些区域被当成了非转录取，而在进行 RNAseq 的时候，发现这些区域可以转录出来，就形成了新的转录本；
还有可能是因为可变剪切的原因。比如一个基因中包含 10 个外显子，那么这么多的外显子可以组合成非常多的形式，但是并不是每一种组合都能够真实转录出来。所以，参考序列的 GTF 中并不能包含所有的外显子组合。而在一些特殊状态下，比如发生了肿瘤的样品中，发生了一些之前没有的可变剪切，就形成了新转录本。
另外，还有一种情况是新发现的一些非基因区转录，这个和基因预测存在误差不同，这些非基因区域本来认为是不转录的，但是事实上却发生了转录，有转录本产生，但是这些转录本并不编码蛋白质，也不属于 rRNA 或者 tRNA 等，比如 lncRNA 就是这种情况。所以，寻找新转录本是 lncRNA 分析的一个基础步骤。
3.5 基因融合
融合基因是指两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因。
融合基因是由染色体重排产生的，包括染色体的易位，插入，颠倒，缺失等。
融合基因的产生改变了基因的蛋白编码序列或调控序列，使得基因功能发生变化，对机体的影响较大。
基因融合示意图
3.6 转录因子测序
转录因子(Transcription Factors, TFs)指能够以序列特异性方式结合 DNA 并且调节转录的蛋白质。转录因子通过识别特定的 DNA 序列来控制染色质和转录，以形成指导基因组表达的复杂系统。转录因子的调控决定着基因的调控网络以及表达水平。
综述文章：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867418301065
转录因子测序方法
3.7 RNA 甲基化检测
RNA 甲基化属于表观遗传学范畴，表观遗传（Epigenetics）是指在核酸序列不发生改变的情况下，遗传物质出现了可遗传的变化，从而导致可遗传的表型改变。目前，表观遗传学已从一个少有人关注的领域变成如今的研究热点。表观遗传的现象很多，已知的有 DNA 甲基化（DNA methylation）、基因组印记（genomic imprinting）、母体效应（maternal effects）、基因沉默（gene silencing）、核仁显性、休眠转座子激活和 RNA 编辑（RNA editing）等，表明表观遗传学确实在癌症、进化、发育等方向发挥着重要作用。
四、RNAseq分类
根据研究的物种不同，可以分为原核转录组和真核转录组，因为原核生物和真核生物基因结构存在很大的差异，在建库测序以及数据分析上有很大的不同，所以要严格区分。还有就是宏转录组，也就是环境样品的转录组测序，由于里面既混合有真核生物，又有原核生物，病毒等，因此非常复杂。
根据建库测序不同可以分为常规转录组与链特异性转录组，转录的基因可以来自于 DNA 的任何一条链，常规转录组无法确认到底来自于哪一条链，而链特异性转录组就是为了解决这个问题，可以区分转录本来自于哪一条链。
根据有无参考序列，又可以分为有参考序列的 RNAseq 和没有参考序列的RNAseq denovo 分析。
根据测序平台可以分为常规转录组，全长转录组，单细胞转录组等。
根据所需要测序目标的不同，可以分为外显子测序，lncRNA，小RNA 测序等。
4.1 有参与无参转录组
所谓有参 RNAseq，主要是指有参考序列的 RNAseq 分析，如图所示，对于有参RNAseq 不需要对转录本进行拼接，而是将测序数据与参考基因组序列进行短序列比对，所有分析内容基于比对结果进行计算，包括差异表达基因筛选，可变剪切，预测新转录本等分析。
RNAseq denovo 分析中， 需要先进行拼接，拼接出一个基因集，然后将这个基因集来作为参考序列，进行短序列比对，在来计算每个拼接出来的基因的表达量。但是很显然，这个拼接出来基因集并不一定完整，因为并不是一次转录过程中，所有的基因都表达了，另外，拼接出来的基因序列都是成熟的转录本，已经没有内含子的信息了，所以无法用来寻找新转录本，也无法用来鉴定可变剪切事件。而且，也没有具体哪条染色体的信息。所以，无法用来鉴定基因融合事件，因为基因融合是通过不同染色体的外显子组合成转录本的事件，没有参考序列，也就没有了染色体的信息。除此之外，SNP、InDel 等需要与参考序列进行比对的分析也很难完成。因此，对于 RNAseq denovo 的分析方法来说，很多分析都无法完成。
4.2 原核转录组与真核转录组
原核生物一般基因组比较小，小于 10M，也比较简单，重复序列比例较小，因此，容易拼接出完整的基因组，所以，对于原核生物，通常可以找到近源参考序列用于 RNAseq 分析，如果没有也可以进行 DNA 测序，拼接出全基因组，用于RNAseq 分析。
原核生物通常只有 1 条染色体，而且是单倍体，因此，不用考虑杂合位点的问题。遗传信息是连续的，不存在内含子。所以，原核不存在可变剪切的情况。也不会有不同染色体上的外显子重新组合，也就是不存在基因融合的情况。
另外，由于原核生物转录出来的 mRNA 加工成熟之后 3‘端没有 polyA 尾巴，因此，在对 mRNA 进行富集的时候，不能采用磁珠富集的方法，原核生物只能选择去除核糖体的方法来富集 mRNA。
虽然原核生物的 RNAseq 很容易获得已发表的参考序列，但是由于原核生物的特点，例如同一物种之间基因组之间差别很大，比如，基因组大小有很大差别，有的具有质粒，有的没有质粒等，这就给选择参考序列造成了很大问题。
原核生物注释信息较少，无法做go和kegg之类的通路富集。
4.3 bulk 转录组与单细胞转录组
bulk RNAseq 是相对于 Single Cell RNAseq 来说的。Single Cell RNAseq（scRNA-seq）是是一项由汤富酬等人在 2009 年首次发表的新技术。文章发表于 Nature Method，测序了 7 个单细胞，两个卵裂球，两个野生型卵子，两个Dicer 敲除的卵 子，一个 Ago2 敲除的卵子。
传统的 bulk RNAseq 进行转录组测序时，样品采样的是多细胞组织，由于细胞之间存在异质性，例如同一个组织同一时间可能有不同的表达状态。这样常规bulk 转录组检测的是样本中所有细胞的均值，而研究的目标可能至于其中某些细胞相关。例如肿瘤组织，传统 bulk 取样测序的样本中即包含了癌组织也包含了癌旁组织，这样肿瘤组织的特性可能就被“平均”掉了，这个时候就采用单细胞测序可以得到更高的分辨率。
4.4 全长转录组
全长转录组（Iso-Seq）是指利用三代测序技术，无需对 RNA 进行打断和拼接，即可直接获得完整的全长转录本。由于该方法可以获得全长转录本，因此与二代短序列测序技术的 RNA-seq 对比，侧重于转录本结构的分析，能够准确识别转录本同源异构体（isoform）、可变剪切、可变 polyA、融合基因、等位基因等，因此在转录本结构分析方面具有无可比拟的优势。
4.5 链特异性转录组
链特异性转录组测序（strand-specific RNA-seq）是指转录组测序过程中文库构建采用的链特异性建库方式。此建库方式可以保留转录组测序时转录本的方向信息，即可以确定转录本是来源于基因组上面的正义链还是反义链。
写在最后：有时间我们会努力更新的。大家互动交流可以前去论坛，地址在下面，复制去浏览器即可访问，弥补下公众号没有留言功能的缺憾。
代码语言：javascript复制bioinfoer.com有些板块也可以预设为大家日常趣事的分享等，欢迎大家来提建议。
