RNA-seq入门实战（九）：PPI蛋白互作网络构建（上）——STRING数据库的使用

连续两次求贤令：曾经我给你带来了十万用户，但现在祝你倒闭，以及生信技能树知识整理实习生招募，让我走大运结识了几位优秀小伙伴！大家开始根据我的ngs组学视频进行一系列公共数据集分析实战，其中几个小伙伴让我非常惊喜，不需要怎么沟通和指导，就默默的完成了一个实战！

他前面的分享是：

Counts FPKM RPKM TPM CPM 的转化
获取基因有效长度的N种方

下面是他对我们b站转录组视频课程的详细笔记

承接上节：RNA-seq入门实战（四）：差异分析前的准备——数据检查，以及 RNA-seq入门实战（五）：差异分析——DESeq2 edgeR limma的使用与比较

本节概览： 1.STRING数据库基本介绍

2.STRING R语言版——STRINGdb的使用：

①STRINGdb数据库导入

②获取STRING_id

③PPI绘制 ④clustering分簇

⑤富集分析

⑥获取蛋白互作信息 3.STRING 网页版的简单使用：

文件上传、各选项设置、数据导出

在得到我们感兴趣的基因集后，除了对其进行GO等富集分析查看与什么重要的生物学通路相关，还可以进行PPI蛋白互作网络（PPI, Protein-Protein Interaction Networks）的构建，查看这些基因之间的联系，进而锁定关键基因。关于关键基因、hub基因，这篇文章说得很详细：关键基因和hub基因（生物网络角度）。

构建PPI网络一般需要使用string数据库获取蛋白互作信息以及进行互作网络的可视化。下面探究一下STRING数据库的网页和R语言版的使用：其他数据库的使用：跟着Cell学作图|9.PPI分析(GeNets数据库)

1. STRING 数据库基本介绍

官网： STRING: functional protein association networks (string-db.org)R语言版本：Bioconductor - STRINGdb

STRING是一个已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。相互作用包括直接(物理)和间接(功能)联系;它们源于计算预测、生物之间的知识转移，以及其他(主要)数据库聚合的交互作用。 STRING中的相互作用有五个主要来源：基因组预测、高通量实验、（保守的）共表达实验、自动化文本挖掘、数据库相关知识。 STRING数据库目前涵盖了来自5′090个物种的24′584′628个蛋白质。

2. STRING的R语言版——STRINGdb的使用

STRINGdb说明书：STRINGdb.pdf (bioconductor.org)或使用命令vignette("STRINGdb")在本地查看说明书。查看STRINGdb的函数帮助文档比较特殊，要用STRINGdb$help("get_graph")的形式。使用STRINGdb时，参数species代表NCBI Taxonomy物种编码，可在此查询：https://cn.string-db.org/cgi/input.pl?input_page_active_form=organisms，其中人为9606，小鼠为10090 。

① STRINGdb数据库导入

首先选择载入的STRINGdb数据（数据库版本、物种、蛋白互作得分）和之前基因差异分析得到的DEG。 STRINGdb$new设置使用最新的11.5版本数据库，物种选择为小鼠（人9606，小鼠10090 ），蛋白互作得分阈值选择700（默认400, 低150，高700，极高900，越高可信度越强）。 DEG结果中选取前100显著差异基因用于后续分析，并将其基因名保存为gene_diff100.txt文件用于后续STRING网页版的使用（特别注意write.table要设quote = F，让字符不要带引号，否则后续上传 STRING容易识别错误）

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rm(list = ls()) 
options(stringsAsFactors = F)
library(tidyverse)  # ggplot2 stringer dplyr tidyr readr purrr  tibble forcats
library(STRINGdb) #BiocManager::install(c("STRINGdb","igraph"),ask = F,update = F)
library(igraph)

setwd("C:/Users/Lenovo/Desktop/test")
load(file = './3.DEG/test_DEG_results.Rdata')
dir.create("7.PPI")
setwd("7.PPI")
######################### 选择STRINGdb类型 #########################
string_db <- STRINGdb$new( version="11.5", #数据库版本。截止2022.5.24最新为11.5
                           species=10090,   #人9606，小鼠10090 
                           score_threshold=700, #蛋白互作的得分 默认400, 低150，高700，极高900
                           input_directory="") #可自己导入数据
########################## 获取DEG结果 ############################
##  筛选条件设置 
log2FC_cutoff = log2(2)
pvalue_cutoff = 0.05
padj_cutoff = 0.05
## 选择DEG
need_deg <- DEG_DESeq2[,c(2,5,6)] ; head(need_deg) 
colnames(need_deg) <- c('log2FC','pvalue','padj'); head(need_deg)
need_deg$gene <- rownames(need_deg); head(need_deg)      #gene symbol或ENTREZID都可
if(T){  
  gene_up=need_deg[with(need_deg,log2FC>log2FC_cutoff & pvalue<pvalue_cutoff & padj<padj_cutoff),]
  gene_down=need_deg[with(need_deg,log2FC < -log2FC_cutoff & pvalue<pvalue_cutoff & padj<padj_cutoff),]
  gene_diff=need_deg[with(need_deg,abs(log2FC)>log2FC_cutoff & pvalue<pvalue_cutoff & padj<padj_cutoff),]
}
dim(gene_up);dim(gene_down);dim(gene_diff)
dat <- gene_diff[1:100] ##这里选取前100显著基因用于后续分析
write.table(rownames(dat),'gene_diff100.txt',row.names = F,col.names = F,quote = F) #字符不要带引号

② 获取STRING_id

使用map获取基因名对应的STRING_id用于绘制string_PPI ，基因名为gene symbol或ENTREZID都可以直接对应获取STRING_id

代码语言：javascript复制

dat_map <- string_db$map(my_data_frame=dat, 
                         my_data_frame_id_col_names="gene", #使用gene symbol或ENTREZID都可
                         removeUnmappedRows = TRUE )
hits <- dat_map$STRING_id

③ PPI蛋白互作网络绘制

完成以上步骤后使用plot_network即可绘制PPI图，还可以给PPI添加上下调信息（上调标记为红色光环，下调标记为绿色光环）

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## PPI
png("string_PPI.png",units="in",width = 10,height = 10, res=400)
string_db$plot_network(hits)
dev.off()
## PPI_halo  #给PPI添加上下调信息
# filter by p-value and add a color column(i.e.green for down and red for up genes)
dat_map_color <- string_db$add_diff_exp_color(subset(dat_map, pvalue<0.01),
                                                  logFcColStr="log2FC" )
payload_id <- string_db$post_payload(dat_map_color$STRING_id,
                                     colors=dat_map_color$color)
png("string_PPI_halo.png",units="in",width = 10,height = 10, res=400)
string_db$plot_network(hits, payload_id=payload_id )
dev.off()

string_PPI.png

string_PPI_halo.png

④ clustering分簇

STRINGdb还能调用iGraph进行PPI的clustering分簇，get_clusters有这些算法可以选择: fastgreedy(默认), walktrap, edge.betweenness，以下代码演示了用 fastgreedy方法对PPI进行clustering，并展示前6个cluster

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## iGraph clustering 互作网络分簇
#algorithm: fastgreedy(默认), walktrap, edge.betweenness
clustersList <- string_db$get_clusters(string_ids = hits ,
                                       algorithm  = "fastgreedy" ) 
# plot first 6 clusters.
png("string_PPI_iGraph_cluster.png",units="in",width = 15,height = 10,res=400)
par(mfrow=c(2,3))
for(i in 1:6){
 string_db$plot_network(clustersList[[i]])
}
dev.off()

string_PPI_iGraph_cluster.png

⑤ 富集分析

除了以上功能，STRINGdb还能对基因集进行富集分析，参数category指定要使用的数据库（默认为All），其中Process, Component, Function分别对应GO的BP,CC,MF三个子集

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#category: All, Process, Component, Function, Keyword, KEGG, RCTM, Pfam, SMART, InterPro
enrichment <- string_db$get_enrichment(string_ids = hits,
                                       category   = "Process" ) 
write.csv(enrichment,"enrichment_GO_BP.csv")

enrichment部分结果

⑥ 获取蛋白互作信息

最后，可使用get_interactions获取蛋白互作信息，再转换stringID为 gene symbol，去除重复（每个相互作用会出现两次），之后导出string_link.csv文件，可在Cytoscape中进一步进行多种可视化操作

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############################## 获取蛋白互作信息用于后续可视化 ###############3
dat_link <- string_db$get_interactions(hits)
# 转换stringID为 gene symbol
dat_link$from <- dat_map[match(dat_link$from,dat_map$STRING_id),'gene']
dat_link$to <- dat_map[match(dat_link$to,dat_map$STRING_id),'gene']  
colnames(dat_link) <- c('node1','node2','combined_score')
# 去除重复
dat_link <- dat_link %>% distinct(node1, node2, .keep_all = T)

write.csv(dat_link,'string_link.csv',row.names = F,quote = F)

3. STRING网页版的简单使用

登录STRING网页STRING: functional protein association networks。在Mutiple proteins中上传我们前面得到的gene_diff200.txt，或者直接将基因名粘贴在第一个框中，再选择物种organism为Mus musculus。