ELISA简介及基于夹心法的PK方法学开发实例

ELISA(酶联免疫吸附反应)指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。

ELISA在抗体药物研发的各个环节有着广泛的应用，从应用目的来说可以分为两类：1. 生物大分子的定量：体内抗体药物的药代动力学，药效生物标志物的含量检测等；2. 亲和力测定评价或者筛选：杂交瘤的滴度测定，噬菌体展示的筛选，抗体和细胞表面受体的亲和力评价等。

1. ELISA实验耗材试剂的选择

应用目的不一样，即使使用同样的试剂材料，也会有不同实验模式和拟合曲线。所以需要根据目的的不同，来选取不同特性的试剂耗材。

1.1 酶标板材

市面上的酶标板材基本都是聚苯乙烯，有的公司会对聚苯乙烯进行修饰以使板子对于不同的包被蛋白具有不同的特性。

一般的酶标板材的说明书上会根据高结合力（Highbinding），中结合力（mediumbinding）的维度进行划分,对蛋白的结合也会由强逐渐变弱，这会带来三个效果：

相同浓度的蛋白包被，结合能力强的比结合能力弱的材料可以在酶标板材上固定更多的蛋白。
板材对包被蛋白的吸附效率提高的同时，非特异吸附的能力也会提高，从而造成非特异信号或背景值变深。
包被的蛋白并不是随机均匀的吸附在酶标板材上，有明显的偏向性，显色时会观察到有些部分颜色较深。会导致在不同的特性酶标板材上，包被蛋白与酶标板材的接触表面不一样，可能会造成位点被屏蔽的现象。如果这个位点恰好是与检测样品结合的位点，样品将会因此无法被检测到。 目前没遇到过位点屏蔽的情况，选用板材多是高结合板材

1.2 包被液

常用的包被液是PBS(pH 7.4)和碳酸钠-碳酸氢钠溶液(pH 9.6)，pH和离子浓度会对包被的效率产生一定的影响，需根据包被蛋白的特性进行具体分析，可参考蛋白产品的COA。包被完成后大部分蛋白还是会留在溶液中，另外酶标板材加入包被液后抽真空可以使包被蛋白以更高的密度吸附在板材上。

1.3 封闭液

封闭液的作用是覆盖酶标板材包被蛋白占据位置以外的空间，以抵抗后续样品或者样品中的其他物质、酶联抗体等对于板材直接的非特异吸附。常用的封闭剂有3%BSA（w/v），5%脱脂奶粉（w/v）等。

有研究表明，封闭剂的封闭效果和封闭分子的大小成反比，所以如果传统的封闭剂起不到很好的封闭效果，选用分子量更小的封闭剂（如：酪蛋白），可能会取得更好的封闭效果。

另外需特别注意：脱脂奶粉中含有生物素，如果检测体系是生物素-链霉亲和素体系，千万不要使用脱脂奶粉作为封闭剂。

1.4 稀释液/洗涤液

常用的洗涤液是PBST(0.1%(V/V) Tween-20 in PBS)。

稀释液会在洗涤液中加入一定的封闭剂成分如1%BSA (W/V ) in PBST。

在体内样品的检测过程中，通常会在稀释液中加入一定浓度的阴性血清如1%的空白血清，以使得不同稀释度的样品有相同的非特异背景。

1.5 酶联抗体

常用的酶联抗体标记的酶主要为AP(碱性磷酸酶)和HRP(辣根过氧化氢酶)。

酶联抗体根据其抗体的分子量由大到小可分为全长的酶联抗体、Fab片段酶联抗体、scFv酶联抗体。

分子量越小的酶联抗体越有可能避免作用位点被空间阻碍的情况，但也增加了酶联抗体绕过封闭剂的阻断与酶标板材进行非特异结合的风险。

1.6 显色液和酶标仪

显色液的选择需与酶联抗体的酶对应，也需和实验室所具备的酶标仪对应。如酶联抗体偶联的是HRP（辣根过氧化氢酶），可以采用TMB显色液，用能够进行吸光度读数的酶标仪进行检测。

一般来说，ELISA方法的灵敏度会受到底物的检测方法限制，化学发光底物能够检测的信号下限要优于荧光底物，再优于吸光度值底物。

在ELISA方法开发时，要选择在酶标仪精密度准确度范围内的OD值范围。

2. ELISA实验方法类型

在ELISA实验中，抗体或者抗原需预结合到酶标板中，再利用辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷脂酶（AP）或者其他化学发光基团标记的抗体或者抗原进行显色反应。ELISA方法分为主要有四种，并各自具有特点：ELISA夹心法、竞争法（测定抗原），间接法（测定抗体）或竞争法（测定小分子化合物）。

2.1 夹心法

夹心法的基本原理是将抗体（抗原）包被到酶标板上，加入待检测样品后，再加入HRP、AP标记的检测抗体，通过显色反应测定待测样品中的特定抗原（抗体）含量。

2.2 间接法

竞争ELISA法被广泛的用于检测小分子抗原，如抗生素，食品农药残留等。与其他几种方法最大的区别是，在实际操作中样品中待测物质浓度越高，显色反应越低；反之，当待测物质浓度越低，显色反应程度越高。这是因为，将抗原固定在酶标板之后，加入待测样品和酶标检测抗体，样品中游离的待测抗原会与酶标检测抗体结合，导致酶标检测抗体与酶标板固相抗原结合数量减少，最终显色反应水平光密度值减少。

3. ELISA方法学开发-生物大分子定量

ELISA方法学开发需要遵循相应的指导原则，比如9012 生物样品定量分析方法验证指导原则。如果一个ELISA方法需要达到精密，准确等验证需求，在定量方法的开发过程中包被抗原的量要远远大于标准品（样品）的量，这样样品能够抵消抗原抗体可逆反应的影响，使得近似所有的抗体样品均被捕捉到，标准曲线如果做对数线性拟合能够得到非常好的线性。

接下来介绍一个检测小鼠血清中PD1方法开发验证实例。

3.1 实验步骤

将100 µL包被溶液加至酶标板的所有孔中，轻拍酶标板以混匀孔内的液体，转移酶标板至4℃冰箱孵育过夜12-18小时。
移除酶标板中的溶液，在平板纸（或同类物料）上轻拍酶标板以除尽剩余液体。加入260 µL洗涤液至酶标板所有孔中，轻拍酶标板以混匀孔内的液体，移除酶标板中的洗涤液，在平板纸（或同类物料）上轻拍酶标板以除尽剩余液体。重复3次。
转移300 µL封闭液至酶标板所有孔中，轻拍酶标板以混匀孔内的液体，将酶标板转移至恒温培养箱中37℃孵育1小时。
孵育结束后，重复步骤2。对于要立即使用的酶标板，可放入4℃冰箱待用，其他酶标板可放入-20℃保存待用。
根据点样方案，在包被板中加入100 µL的稀释好的样本，轻拍酶标板以混匀孔内的液体，将酶标板转移至恒温培养箱中37℃孵育1h。
孵育结束后，重复步骤2。
转移100 µL 检测抗体溶液至酶标板相应的孔中，轻拍酶标板以混匀孔内的液体，将酶标板转移至恒温培养箱中37℃孵育30min。
将TMB从4°C冰箱取出，室温放置5～10分钟回温。孵育结束后，重复步骤2。
将100 µL显色工作液加至酶标板相应的孔中，室温孵育10±5分钟。
将100 µL终止液加至酶标板相应的孔中，终止显色。
终止显色15分钟内使用酶标仪读取光密度信号值，检测波长选择为450 nm。

3.2 实验试剂的准备

标准品标准品可以是商品化的已知浓度的蛋白分子，也可以是自制的、已知浓度的纯度较高的蛋白分子。标准品一般为7-8个浓度点，拟合成合适的浓度-信号剂量曲线作为标准曲线进行内控品和样品的定量。此处选择商品化的PD1蛋白。
包被抗原选择商品化的PD-L1蛋白(his标签)，购自ACRO。
包被液根据包被抗原说明书，选择合适的包被液及包被浓度。常用的包被液是PBS(pH 7.4)和碳酸钠-碳酸氢钠溶液(pH 9.6)
封闭液 3%BSA（w/v）
洗涤液 PBST(0.1%(V/V) Tween-20 in PBS)
稀释液 1%BSA (W/V ) in PBST。
检测抗体可与PD1非PD-L1结合位点结合的HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗。
显色液 HRP标记的二抗选择TMB显色液(辣根过氧化物酶的常用底物)，显色时变为蓝色。针对不同标记的二抗，选择不同的显色液。
终止液加入显色液等体积的1M 盐酸或硫酸溶液终止反应，孔中反应液由蓝色变为黄色。