这篇文章是2022年3月发表在science上的一篇关于选用单细胞测序技术揭示番茄地上根形态建成的机制，以及地下根形成的一篇文章。
图片.png原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abf4368
doi：10.1126/science.abf4368
该研究是以色列耶路撒冷希伯来大学的Idan Efroni 团队，与美国纽约冷泉港实验室的Anat Hendelman 团队合作完成。
目前在science上Lidor Shaar-Moshe和Siobhan M. Brady也对文章做了评述。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abo2170
doi：10.1126/science.abo2170
研究背景
维管植物分为根和茎两大部分。根是通过根分生组织分化形成的，根分生组织含有组织特有的干细胞，排列在缓慢分裂的静止细胞周围，主要由根冠细胞保护。
Doerner P， 2003.png初生根分生组织由胚基部形成，主要是发生在胚胎发育阶段。
Maarten Koornneef, 2001.png胚胎发生后，侧根分生组织由初生根的中柱组织分化而来。该机制整合了生长素反应、根生长速率、局部细胞壁修饰和化学信号来启动特定的中柱细胞。
Bennett MJ， 2009.png虽然根-冠谱系在胚胎发生的早期发生分离，但大多数植物也可以启动茎生根形成多个独立的根系。这些根通常被称为“不确定的”，意思是“在错误的地方”长的根。例如在玉米中的芽生根现象，主要是受到了rtcs基因的调控，这个基因带有一个保守的LBD domin，这个domin是调控侧生分生组织的保守基序。通过对芽生根的区域进行切片观察，发现芽生根的发生区域应该是在维管束的外围区域。
Schnable PS，2013.png芽生根是许多植物正常发育的一部分，根据化石记录，芽生根是早期被子植物的主要体型。现在植物学家通过植株是否受伤将地上根分为两大类，一类是自主产生的不定根，一类是由愈伤组织诱导产生的不定根。通过对拟南芥的叶片进行愈伤组织测试，发现伴随着天数的增长，在愈伤的部位，产生了不定根，同时伴随着有大量的IAA积累，表明愈伤组织产生的不定根也受到了IAA的调控。
Liu J， 2014.png然而，人们对这些根的起源知之甚少，它们的起源组织也存在争议，芽生根、侧根和伤根之间的个体发育关系也不清楚。
生长素和细胞分裂素这两种植物激素在生根过程中起着关键作用。生长素反应在侧根分生组织祖细胞中被激活。生长素通过激活侧生器官边界结构域(LBD)转录因子等多种下游过程，包括促进细胞生长和有丝分裂。其他生长素诱导的转录因子，如PULSEORA/AINTEGUMENTA家族的成员，是建立适当的细胞分裂模式和在后期获得特定细胞命运所必需的。
Chang L， 2015.png
Kang NY， 2013.png来自单子叶植物的部分研究表明，类似的基因可能在枝生根和侧根的发生中都起到了作用。在玉米和水稻中，茎生根的发生需要生长素诱导的LBD转录因子分别涉及冠根和种子根(RTCS)和冠状ROOTLESS1(CRL1)，以及PULTORA/AINTEGUMENTA(PLT)家族蛋白CRL5。
Inukai Y，2005.png结果
番茄SBR(不定根)的分化
常见的模式植物拟南芥缺乏茎的伸长，其下胚轴很少产生茎生根。因此，为了研究高分辨率的双子叶茎生根，选用番茄作为研究材料。一种藤本植物，能从容易接近的茎上自然地长出大量的根。
图片.png首先通过对生长中的番茄进行SBR数量的统计，发现可以将SBR分为两个阶段，一个SBR起始阶段，一个是SBR形成阶段，在这一发育过程中，SBR的数量逐渐增多，且SBR的直径数量不断增大，表明番茄是一个较好的研究SBR的材料。
图片.png通过对番茄的节间进行分节观察，发现从年轻的节间不断出现SBR，形成一个发育梯度，较老的节间有更发达的SBR。
图片.png并对节间的茎进行切片发现，SBR主要在维管组织区域形成，优先位于维管束边缘。
图片.png番茄SBR的产生与激素诱导有关
为了研究细胞增殖激活前的情况，研究者构建了一个带有生长素(DR5)和细胞分裂素(TCSn)的双色转录报告系统(DR5：mScarletiNLS TCSn：mNeonGreen-NLS)。在根分生组织发生之前，可以观察到TCSn在韧皮部远端区域零星表达。在~4周龄植株中，在节间伸长停止后立即发生根起始事件，以生长素和细胞分裂素信号的诱导为标志。随后，生长素和细胞分裂素反应报告的表达被分成两个区域，类似于成熟的分生组织，尽管仍有重叠的区域。将这个发育阶段主要划分成5个不同阶段。发现SBR是起源于初生韧皮部的分化区域中。同时作者也在带有生长素敏感反标记pIAAmotif的西红柿中观察到了类似的动态变化。
图片.png在拟南芥中，生长素细胞分裂素反应的瞬时重叠被报道发生在胚根分生组织起始期间，而不是在侧根起始期间。
Müller B， 2008.png同时发现这些激素的动态变化在番茄胚胎中是保守的，生长素和细胞分裂素的反应都在基细胞重叠，然后在顶细胞分离。在侧根发育中也是最初的侧根细胞以生长素反应为标志，两侧是细胞分裂素反应为主。而芽生根的生长素和细胞分裂素的反应在分化的初级韧皮部细胞开始的，表明侧根与芽生根的起源是不同的。
图片.png番茄SBR的单细胞图谱
为了查看韧皮部细胞形成根分生组织的轨迹，选用了第1、3和5阶段的根分生组织以及根起始前的韧皮部相关组织的来进行单细胞mRNA图谱构建。为了分离这些非常稀有的组织，在显微镜下对组织进行了分期和显微解剖，然后根据激素反应报告使用流式分选对细胞分类。
图片.png经过质量控制，共获得了3087个细胞(分别来自第1、3和5期来源组织的893、621、445和1128个细胞，经过聚类后获得13个亚群。并选用ICI算法，基于已发表的数据，进行细胞注释，分别识别木质部、韧皮部、干细胞、根冠和维管系统初始细胞群(分别为簇3、5、8、9、10和2)。两个簇(8和9)被归类为干细胞，并富含几种根干细胞调节因子的表达(图3)。(中六)。stage origin和1 的SBR富集到大量皮层和韧皮部细胞，猜测这一部分可能是一类形态相似的韧皮部和皮层细胞，stage 1细胞的三分之一被归类为韧皮部薄壁组织或韧皮部，表明芽生根来自于该组织。
图片.png番茄SBR的起源
对这个亚群进行轨迹分析，确定该簇是根冠和干细胞(簇9和10)之间的分支点，这表明，这种短暂的细胞身份，作者称之为“过渡”，代表了新的芽生根分生组织的祖先。对这个亚群进行GO分析，发现两个干细胞簇的GO分析结果相似，但对细胞分裂素的反应和RNA干扰机制的诱导是过渡细胞独有的。总体而言，通过单细胞分析证实，芽生根来自分化的韧皮部薄壁组织，并确认了在韧皮部薄壁组织向根分生组织的转变过程中形成的先前未描述的细胞身份
图片.pngSBRL基因定位
为了确定过渡干细胞的潜在调控因子，作者查找了在韧皮部薄壁组织向干细胞发育过程中表达变化，并与晚期干细胞相比在过渡过程中表达丰富的因子，这包括128个基因，其中5个是转录因子：一个AP2/ERF，两个MYB，一个C2H2锌指和一个LBD。其中一个候选基因，LBD基因Solyc09g066270，是过渡细胞高度特异的基因，在番茄转录图谱中具有根特异表达。Solyc09g066270是一个IB类LBD，这个分类的成员之前研究被认为与生长素下游的根发育调节有关。向番茄节间1注射生长素诱导了Solyc09g066270的表达。这种诱导通过与生长素和细胞分裂素共同处理而被抑制，与长时间细胞分裂素处理对生根的抑制作用一致。
图片.pngSBRL基因功能
为了鉴定Solyc09g066270的功能，作者使用CRISPR产生了四个独立的无效等位基因。突变体萌发正常，可育，枝条形态正常。
图片.png前人研究在淹水条件下，可以诱导SBR的产生。
Müller B,2010.png因此将SBR突变体置于淹水条件下，也不能产生SBR。当番茄的茎从主根系统中切下时，它们很容易形成茎生根，但在突变体中也没有这种伤害诱导的根形成。
图片.png下胚轴与茎主根的发育来源不同，直接来自胚胎组织。大部分受伤诱导的根在切断的sbrl下胚轴中消失，但少数根仍能从伤口处形成的愈伤组织中分化出来，这表明这些根可能受到明显的遗传调控。为了确定sbrl突变体中的缺陷是在根起始还是出苗中，作者构建了sbrl DR5：Venus-NLS 株系。6株植物韧皮部组织中DR5表达的阶段1或细胞分裂异常，表明SBRL是根形成的最早阶段所特需的。
图片.png在被子植物中SBRL调节SBR是保守的
为了确定这些基因之间的进化关系，作者生成了一个845类IB 基因来源于94个植物类型。苔藓和石蒜的基因与I亚类相似，但形成了5个支系的外群。亚类II出现在种子植物中。III亚纲分为裸子植物特有的IIIg亚纲和被子植物特有的IIIA和IIIB亚纲。SBRL、RTCS、和CRL1均被归为IIIB亚类。
图片.png发现IIIB亚类的基因在单子叶和双子叶植物中都存在，但是单双子叶植物在1.5亿年就进行了分化，因此作者猜测这个基因有可能在被子植物的表达是很保守的，因此首先选择了马铃薯和菜豆进行验证，这两种种植物可以自然产生SBR。
由于在发育阶段中两种植物不是同步的，因此根据节间的生长情况的发育梯度进行了逐步取样，并进行qpcr验证两个物种中的IIIB类基因的表达情况，发现IIIB类基因都是在SBR分生组织形态出现之前表达。
图片.png为了测试这些表达模式是否在单子叶植物中保守，作者测试了IIIB类基因在高粱茎生冠根发生过程中的表达。与双子叶植物一样，该基因在冠根的形态出现之前检测到了瞬时表达。表明IIIB亚类基因在SBR起源阶段出现。
图片.pngSBRL基因在愈伤组织诱导生根中的表达情况
为了确定IIIB亚类的功能是否保守，作者在马铃薯(Solanum Tuberosum)的SBRL，StSBRL的直系同源中产生了CRISPR突变体(表S3)。马铃薯在培养中繁殖时很容易产生茎生根，但三个独立衍生的CRISPR纯合子突变体未能形成根。
图片.png有研究表明从主根系统切开或黄化的幼苗暴露在光照下时，拟南芥的下胚轴上可以形成几个根。
Sukumar P， 2013.png因此作者猜测SBRL拟南芥同源基因(LBD17/29)在去除根后后在下胚轴中是否会被诱导表达，lbd17和lbd29缺失突变体切除下胚轴上后的表达量和生根数都减少了，lbd29突变体在这些根的数量上有更显著的减少，表明这些同源基因功能的保守性。
图片.pngLBD超基因座的深度保守性
最后，通过进化分析，发现LBD基因尽在两个多肉植物和水生植物中缺失，在其他植物中保留了这个SBR的功能。这三个物种的共同之处在于，它们在进化过程中失去了根基。综上所述，以上的数据表明被子植物茎生根的起始程序及其被IIIB LBDS亚类的特异性调控是非常保守的。
在构建系统发育树的过程中，作者观察到iib亚类基因几乎总是紧挨着已经存在于基本分化被子植物中的单个超基因座上的一个iia亚类基因。对来自四个科的80种植物进行顺式调控元件分析，揭示了基因座内广泛的非编码区的保守性，其中包括多种生长素和细胞分裂素反应元件。也发现这两类基因的蛋白的motif的高度同源，
为了验证该调控序列的功能是否保守，作者构建了番茄SBRL及其同源亚类基因IIIA的调控序列的双重报告基因(BSBRL；pBSBRL：mNeonGreen-NLS-BSBRLTerm pSBRL：mScarleti-NLS-SBRLTerm)，并将其导入拟南芥。尽管这些物种在大约1.2亿年前就已经分化，但番茄的调控序列足以驱动mScarleti在根原基中的表达，该原基是在去除根系后在拟南芥下胚轴上形成的。
图片.png亚类IIIA基因可能在侧根的发育中起保守作用
虽然iia和iib类基因的高度同源，但是在单细胞的数据当中没有发现BSBRL2基因的表达，之前的研究中发现RTCN和LBD16亚类基因分别与侧根发育的调控相关，这表明可能与SBR中IIIB亚类基因的功能类似，IIIA亚类基因在侧根发生中可能起到保守的作用。为了验证这个猜想，作者生成了番茄侧根发生的转录时间序列。IIIA和IIIB两个亚类基因在启动侧根时都被瞬时诱导，这种表达模式在菜豆、马铃薯和高粱中都是保守的。
在这些品系中观察到了一些异位表达，但由于技术限制，在报告载体中只存在34-kb基因座中保守的非编码区的一部分。侧根原基中IIIA/IIIB亚类基因的瞬时表达及其核心调控密码子高度保守。
图片.pngLBD基因对根系特异性调控
为了测试IIIA亚类基因的功能作用，作者构建了番茄bsbr1和bsbrl2的CRISPR突变体。这些突变体和sbrl突变体都表现出侧根数量的轻微但显著的减少，拟南芥中同源基因的突变体也是如此。
图片.png但bsbr1和bsbrl2突变体的茎都有正常的茎生根形成，切段茎上的生根数与对照无显著差异。
图片.png为了证明这些基因在侧根发生中起着冗余的作用，我们用一个6个位点的多重CRISPR来定位整个SBRL-BSBRL超基因座，并检测了4个独立衍生的等位基因。
图片.png发现所有sbrl bsbrl双突变体都完全缺乏SBR，侧根数量显著减少，而枝条未受影响，切断双突变体的下胚轴仍能产生创伤诱导的根，对这些创伤诱导的下胚轴根在sbrl突变体中的时间序列表达分析表明，复制的IIIA亚类基因BSBRL2，而不是BSBRL，在这种根类型中被瞬时诱导。
图片.png为了测试这些受伤诱导的根是否依赖于IIIA/IIIB亚类，我们产生了一个三重sbr1 bsbr1 bsbrl2突变体。虽然萌发缓慢，但这些植物形成了正常的初级胚根。三个突变体的下胚轴切割后均不能形成伤根，只有愈伤组织样细胞在切割部位有明显的增殖。此外，发现单sbrl和双sbrl bsbrl突变体在土壤中生长时仍能发育出相当大的分枝根系。在缺乏三个亚类IIIA/IIIB基因的植物中，无论是在平板上还是在土壤中生长，根本没有胚后根发育。因此以上数据表明，在早期被子植物中出现的IIIA/IIIB亚类基因是胚后根发育所必需的，具有一个保守的程序，驱动个体在不同的发育背景下控制根的启动。
图片.png总结
综上，根分生组织的形成起始于一种与高度保守的IIIA和IIIB亚类基因相关的共同过渡状态。这些基因控制着不同类型根的起始，IIIB亚类在SBR起始中发挥作用，而IIIA亚类在侧根和一些伤口诱导根的发育中起作用。在早期被子植物中，IIIA亚类和IIIB亚类基因的超位点的出现，使得不同类型根的遗传调节得以专门化，从而使植物能够对不同的环境做出复杂的发育响应。
参考文献
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