摘要：大脑皮层中θ波振荡的网络水平同步与日常生活中的许多重要认知功能有关，如执行功能或觉醒和意识的调节。虽然神经影像学已经揭示了认知中θ节律的普遍功能相关性，但仍存在一套有限的技术来外部增强和稳定人脑中的θ节律。本研究开发了一种新型的相位同步低强度电磁刺激技术，在一组健康成人参与者中诱导并稳定了窄带6-Hz的θ波振荡，并证明了该技术如何通过工作记忆增强认知加工。我们的发现表明了脑刺激方法的技术进步，同时也证实了θ波活动与并发认知行为之间的因果关系，这可能最终不仅有助于解释机制，而且为神经精神疾病中观察到的θ波网络活动的恢复提供了前景。
1 引言
基础和临床神经科学的一个关键研究目标是准确确定特定皮质区域内和特定皮质区域之间的神经振荡如何以及在多大程度上与认知过程存在因果联系。从20世纪80年代初开始在人类中引入经颅电刺激以来，人们越来越关注以神经元振荡为靶点的无创电刺激和磁刺激技术的发展。在过去的十年里，要么是通过提供低强度正弦交流电流(TAC)，要么是通过固定重复频率的电磁脉冲(重复经颅磁刺激-rTMS)。到目前为止还没有一种既能在目标频率上诱导神经振荡，又能在较长时间内稳定活动的方法。此外，使用双边rTMS TACS蒙太奇可以进一步由于皮质-皮质相关性和网络皮质振荡器的亚稳态动力学的贡献，在功能网络水平上增强了稳定神经振荡的功效。为了满足这一需要，我们开发了一种新的刺激方案，其中单个电路精确地同步rTMS脉冲和目标频率下的TAC的相位(图1A，B)。通过这种双重同步和组合的方法，我们证明，将rTMS脉冲精确地定时到TAC的峰值相位，可以可靠地在双侧前额叶皮质诱导和稳定长达30分钟的10赫兹振荡-在健康和静息的人脑中，该区域的内源性α活动预计是低的。在本研究中，我们的目的是探索这种双相同步刺激技术是否也可以增强和稳定额叶皮质的θ振荡，这种技术是否在功能上也有效地增强健康成年人的认知过程。基于越来越多的证据表明，跨额叶和颞叶皮质的θ同步与增强的工作记忆编码和提取有关，我们假设，额外增强和稳定θ频率范围内的振荡活动可以改善工作记忆。
图1 方法学和实验设计的概念性生物物理模型。(A)多模式rTMS和TACS刺激蒙太奇由4个来自多通道刺激器的TACS电极组成。(B)每个rTMS脉冲的传送被编程为与TACS正弦波的最大正峰对齐。(C)电场模拟显示TACS引起的电场大小。(D)电场模拟显示rTMS脉冲在前额叶皮质传递时，TACS峰值灰质表面的TACS电场的法向分量。(E)实验1：以基线记录睁眼(EO)和闭眼(EC)状态下的静息状态脑电开始，每组持续2分钟。(F)实验2：会议开始时，记录1背部和3背部任务绩效的基线，并伴随着任务相关活动的触发登记脑电记录。
2 材料和方法
2.1 对人体试验的批准
该实验符合《赫尔辛基宣言》的原则，并得到了莱布尼茨工作环境和人类因素研究中心机构审查委员会的批准。在当前研究期间生成的数据集可在合理要求下从相应作者处获得。
2.2 被试者
实验一招募26名健康的右利手个体，招募28名健康右利手参与者。在实验开始之前，所有参与者都经过医学专业人员的筛查。所有受试者都提供了他们的书面知情同意。
2.3 刺激
我们开发了一种定制电路，以在经颅交流电刺激(TACS)波形内的精确施加相位同步经颅磁刺激(TMS)脉冲，目的是在两个半球的每一个半球提供双侧和同时的同相刺激。图1A给出了电路的概述(见图1)。
2.4 脑电图
使用64通道EEG系统记录EEG。我们测量了52个Ag/AgCl EEG电极的神经活动，不包括刺激电极下方或邻近的10个通道(F3、F4、TP9和TP10上的中心点)。采样频率为2000Hz，采用在线1000Hz低通滤波器采集，脑电阻抗维持在5kOhms以下。
2.5 整体实验过程
2.5.1 实验1：静息状态脑电
每个参与者在一天中的相同时间参加所有实验，实验间隔至少7天。在初步实验中，每个受试者的AMT是通过在左侧初级运动皮质上施加单脉冲TMS来确定的，以从右侧小展肌(ADM)诱发运动诱发电位。分别记录睁眼(EO)和闭眼(EC)状态下的脑电记录，每组记录2分钟。在20分钟的刺激过程中，参与者被指示睁大眼睛，盯着监视器上的十字架。刺激结束后，每隔10min至60min记录一次睁眼和闭眼的静息状态记录(时间点为1min)。我们设计了五种刺激方案，应用于随机序列(图1D)。电极电缆只在刺激过程中连接，然后在记录的其余部分断开连接。
2.5.2. 实验2：N-back工作记忆任务
按照与实验1类似的过程。受试者被要求记住以连续顺序呈现的字母表字母，目标是对之前出现一个刺激或之前出现3个刺激的靶探测作出反应。反应是使用专用鼠标获得的行为表现采用信号检测理论进行分析。在整个治疗过程中持续记录和监测脑电。
2.6 脑电分析
2.6.1 预处理和静息态谱功率分析
使用Matlab（R2018b）中的Fieldtrip工具箱对EEG进行离线分析。原始数据被下采样到512Hz。采用1-90 Hz带通滤波器来衰减高频和低频噪声分量，并进一步采用50 Hz陷波滤波器来降低电力线噪声。在预先定义的频率（6 Hz）和前额F5、F6、Fz、FC3、FC4、AF3、AF4、F1、F2、F3和F4电极上，对功率的变化进行统计分析。我们还评估了所有频带的EEG频谱功率的更广泛变化。除6 Hz频率外，我们还分析了δ、、α、β和γ EEG频带的更广泛（1–90 Hz）功率变化。此外，还对静息状态脑电图进行了传感器层面的全脑分析。
2.6.2 额叶和顶叶θ同步的任务相关变化
为了评估工作记忆处理过程中刺激引起的θ同步变化，我们测量了θ频率范围内任务相关功率的频谱变化。为了捕捉相关的编码和检索过程，同时避免捕捉由反应的运动成分产生的非相关活动，对于每个n-back任务，在n-back线索刺激开始后0-500ms的时间窗口内，计算额叶和顶叶电极位置的相对时频功率变化。使用刺激开始前-150ms到0 ms的平均4–8 Hz活动进行基线校正。在单次试验水平上应用标准化，然后对所有试验进行平均。在编码/提取过程中与任务相关的额叶和顶叶θ功率的平均变化被统计处理为因变量。
2.6.3 全脑功能连接性分析
功能连接性是通过计算加权相位滞后指数(WPLI)来评估的，该加权相位滞后指数(WPLI)是在Matlab的开源FieldTrip工具箱中实现的。WPLI是两个时间序列信号之间的相位同步化的量度，它代表交叉频谱的虚部分量的绝对值，与样本大小有关，并且对体传导噪声不那么敏感。各加权相位滞后指标用相角差的分布来表征。瞬时相位滞后和幅值可以通过交叉功率密度谱获得。使用全局效率的图论参数在整个大脑水平上分析了功能连接。具体地，全局效率被定义为网络中所有节点之间的平均特征路径长度的倒数。在实验1中，在静息状态数据的每10分钟时间点，为无伪影的1s时间点构建全脑连接矩阵，而在实验2中，在n-back试验的编码/提取窗口中构建连接矩阵。
2.7 统计分析
使用SAS JMP Pro进行推断统计。所有相关的兴趣指标都被输入到线性混合模型中，这使得我们能够灵活地对实验因素的固定影响进行建模。使用LMM能够用所有可用数据对重复测量随时间的影响进行建模，并灵活地对符合各种分布的数据进行建模。在所有模型中，都使用了约束最大似然估计和复合对称或非结构协方差矩阵。检验残差的散点图以检验模型形式的假设，并使用Akaike信息准则(AIC)和贝叶斯信息准则(BIC)来估计模型拟合度。对于每个协议和n-back任务，我们分别比较了D-Prime与全局效率、额叶和顶叶的θ同步之间的关联。
2.8TMS和TACS电场的有限元模拟
使用SimNIBS v3.0在数据集中提供的模板头部模型上计算了两种类型激发产生的电场分布。在DC范围内(白质：0.15S/m，灰质：0.4S/m，脑脊液：1.79S/m，眼球和头皮：0.33S/m，头骨：0.008 S/m)，组织被指定为均匀各向同性电导。对于TAC，将四个半径为2 cm的圆形电极放置在F3、F4、TP9和TP10上，电极层厚度为1 mm，凝胶厚度为4 mm(电导率为8S/m)。这种效应是在准静态近似下仅在DLPFC上的最大激发电流峰值时计算的，即在F3/F4处为 0.5 mA，在TP9/TP10处为-0.5mA。灰质上电场的法向分量可以由电流密度向量除以灰质的电导率得到。
3 结果
为了探索这项技术在调节θ振荡和工作记忆加工方面的生理和功能有效性，我们进行了两个实验(见图1E-F)。
3.1 实验1
在第一个实验中，我们的目的是验证相位同步刺激技术是否能够调制静息状态下人脑前额叶皮质中的θ振荡的功率。为了实证检验这一假说，我们进行了一系列实验，其中刺激以6赫兹的频率同时和双侧作用于背外侧前额叶皮质。多模式多通道刺激蒙太奇由四个TACS电极组成，两个通道将交流电从左右前额叶皮质同相传递到各自的同侧乳突区(图1A)，从而产生从额叶皮质的颞区到更深的腹区的电场分布，也包括丘脑的部分(图1C)。两个TMS线圈直接放置在每个前额TACS电极上，并通过基于光耦合器的电路接收来自TACS设备的信号，该电路在相对于TACS正弦的精确时间点触发脉冲(图2)。S1)。电场模拟证实，TMS和TACS的诱导电场效应是一致的，当TMS脉冲施加在TACS诱导的正弦波的峰上时，TMS诱导的电场效应最大(图1D)。在刺激结束后即刻(1min)和每隔10min至60min，评估目标前额叶区域6 Hz的窄带振荡变化作为主要结果指标。
通过分析观察到，与刺激前基线(图2B)和假刺激(图2B)相比，在睁眼(EO)和闭眼(EC)条件下，rTMS TACS联合刺激导致更宽阔的额叶皮质6赫兹活动增强。有趣的是，在联合方案后，也观察到左侧顶叶区域的θ活动增强(图2B)。术后比较显示，在EO静息状态下，6 Hz同步rTMS TAC较基线和假手术(图2C)最大程度地增加了6 Hz前额叶功率。对于EO状态，这些效应在刺激结束后持续40分钟(图2D)。EO条件下的效果持续到60min(p=0.013；图2D)。对于EC静息状态，多项比较校正t检验没有显示两种方案之间的显著差异。我们还比较了联合刺激方案是否优于单独使用每种刺激方案(rTMS或TACS)。仅在EO条件下，两种联合方案对rTMS的作用大于rTMS，而单独使用TACS的差异呈趋势，但差异无统计学意义。
第二项分析是为了确定在整个大脑网络水平上6赫兹振荡的功能连接性的变化程度。为此，计算了整个大脑的全局效率，并以与前面描述的相同方式输入到线性混合模型中。与静息状态6赫兹功率的变化类似，观察到全局效率略有增加。在EC条件下，在校正多重比较后，在组内t检验中没有观察到显著差异。
3.2 实验2
在第二个实验中，我们调查了6赫兹同步刺激的影响是否也调节了认知过程。28名受试者参加了五次重复的字母n-back任务。在参与者完成任务的同时，脑电被记录下来。使用敏感度d-质数指数对行为表现进行统计评估。总体而言，与预期的3-Back相比，1-Back的任务表现更好(图3A)。在随访的后评估中，rTMS TACS6 Hz方案和rTMS TACS 6×80CF方案与Sham相比都有显著的性能提高(增加的d-素数)(p=0.045和p=0.045；图3B)。工作记忆加工过程中的生理变化作为刺激的函数被用两个结果测量来评估：(1)工作记忆编码和提取过程中额叶和顶叶区域任务相关功率的变化；(2)工作记忆编码和提取过程中任务相关功率频率的整体效率。最后，我们探讨了在工作记忆编码和提取过程中，是否可以通过刺激引起的额叶/顶叶任务相关功率的变化或功能网络的整体效率的变化来预测刺激引起的n-back成绩的变化。虽然生理和行为变化的方向似乎暗示了潜在的关系，但双变量相关分析没有显示这些各自变化之间的显著相关性。
图2 刺激引起静息状态振荡活动和功能连接的改变。(A)整个大脑，传感器水平的t对比，比较每个方案的刺激后6赫兹的总平均活动与基线活动。(B)比较每个主动刺激方案在6赫兹活动中的总平均变化(从基线)与假刺激的全脑、感应器水平t对比。(C)刺激前和刺激后时间点(1-60分钟)前额叶通道6赫兹功率的平均变化。星号表示方案之间的显著成对差异。(D)前额电极的6赫兹脑电功率随刺激方案和时间的变化。(E)总体而言，全球功能网络效率在6赫兹时的总体平均变化(1-60分钟)。(F)作为刺激方案和时间的函数的6赫兹全局效率的变化。
图3 刺激引起的 n-back 任务表现、任务相关的额叶和顶叶 theta 功率和全局效率的变化。(A)刺激前(基线)和刺激后1-和3-back任务的群体行为表现。(B)作为刺激方案的函数的d素数的变化。(C)与任务有关的θ功率和网络连接的变化。(D)与任务相关的额叶电势随刺激方案的变化。(E)与任务相关的顶叶电势随刺激方案的变化。(F)作为刺激方案的函数的任务相关的全局效率的变化。
图4 在实验1中，参与者之间的个体间差异。绘制两种联合刺激方案和假刺激方案的每个个体静息状态6Hz功率的总平均变化图，以可视化参与者之间以及会话之间的分布。
4 讨论
本研究结果表明，6赫兹的rTMS和TACS的相位同步可诱发和稳定6赫兹的振荡活动，其作用在刺激结束后可持续40分钟。此外，通过增强言语工作记忆的表现，相同步刺激导致了行为的功能变化。这里描述的新的相位同步刺激技术是开发安全的非侵入性脑刺激工具的一个值得注意的进步。在几项研究中，TACS被证明能够敏锐地稳定窄带频率特有的振荡活动，并在刺激后持续一段时间内稳定。然而，当施加刺激频率较远的频率时，这两种影响都会减弱。RTMS已被证明更适合于在目标窄带频率诱发振荡爆发。通过将这两种技术组合在一起，我们表明，通过TMS传递强阈值上旧脉冲的电磁刺激与通过TACS进行较弱阈值下正弦电刺激的同相传递似乎是激发和稳定振荡的双重互补策略。对于两种相位同步rTMS TACS协议，在6 Hz频率下观察到最强的影响，而在7和8 Hz下的影响相对较弱(见图3)。此外，我们还观察到rTMS TACS方案引起了23和24赫兹频率的变化，这可能与6赫兹的谐波有关。这种后效模式暗示了刺激频率和振荡活动之间的直接相互作用，正如先前的rTMS和TACS研究中观察到的那样。因此，结合这两种技术的相位同步方案，可以用于对大脑振荡进行可控的选择性干预。
我们还观察到了峰值同步的积极发现，尽管还需要进一步的实验来澄清这个频率的相位关系。以接近底层皮质自然共振频率的频率施加TACS可能有效地快速建立突触可塑性效应。在感觉运动皮质上施加20赫兹的TAC既可以增强20赫兹的本地振荡活动，也可以在刺激结束后的几分钟内增强运动皮质的兴奋性。
阶段同步刺激方案对工作记忆加工的增强说明了认知过程中增强的θ振荡的相关和因果关系。根据常规估计，这些刺激方案产生的效应大小为中等。原则上，这些发现支持了先前的研究，即TACS应用于θ区导致刺激时工作记忆增强的研究。在工作记忆编码和提取过程中，额叶和顶叶任务相关的同步化在θ频段(4-8赫兹)也有相应的增加。动物和人类的一些研究都发现，工作记忆加工背后的作用机制涉及激活工作记忆频率范围内的振荡发生器。因此，很容易推测，对θ活动的直接调节是在3-back任务中观察到的行为改善的原因。虽然我们在1-back任务中观察到了类似的生理变化(与任务相关的额叶和顶叶θ同步化的增加)，但我们没有观察到任何任务绩效的行为变化，这可能是由于天花板效应。同时，我们不能完全排除3-back任务中的整体行为变化是否可能是由与记忆回忆有关的其他机制的调制驱动的，而不是诱导的θ振荡增强，因为我们没有直接观察到任务相关的θ同步或功能连接的行为改善与生理变化之间的被试相关性。尽管如此，鉴于先前的研究表明增强的θ和工作记忆成绩之间存在联系。值得注意的是，与最近一项显示工作记忆增强的θ频段TACS研究相反，我们的结果并不依赖于在单个θ频率上施加刺激。由于这些改善是在刺激结束后相对较短的时间跨度内探索的，进一步的研究可能需要彻底检查这种增强的时间稳定性。
这项研究的第二个目的是探索θ-γ TACS是否可以调节大脑中的θ-γ交叉频率耦合。θ-γ交叉频率耦合，特别是相位-幅度耦合，已被证明在学习和可塑性中起着功能上的重要作用。事实上，最近使用TES的研究已经证明，θ-γ耦合对工作记忆绩效至关重要。在此背景下，我们探索了开发一种rTMS TACS协议，通过该协议，将正弦6 Hz TACS波形修改为包括80 Hz脉冲，是否可以1)潜在地增强θ和γ静息态振荡，以及2)提高我们n-back工作记忆任务的认知绩效。在静息实验中，我们观察到rTMS TACS-6×80CF方案在刺激后60min内较假手术组持续增加6 Hz功率，而在80 Hz振荡下则无此作用。在认知工作记忆实验中，我们观察到rTMS TACS-6×80CF协议增强了高负荷工作记忆成绩，但其效果并不明显大于基本的rTMS TACS 6 Hz协议。这两个协议的一个相关区别是与任务相关的在顶叶皮质上的功率的变化(图3E)，然而，仅使用6赫兹TACS方案也观察到了这种影响。在给定这些观察的情况下，情况可能是，至少对于由n-back范例索引的言语工作记忆而言，跨频TACS协议可能不是进行工作记忆处理所严格必需的。不能排除这种协议是否更适合于参与其他更复杂的工作记忆任务。我们没有系统地评估执行θ-γ跨频方案的技术参数，这些可能相关地影响神经生理反应。此外，我们的刺激设计是离线的，因此不能与工作记忆任务同时进行，也不能与同时进行的脑电记录同时进行，这可能会限制我们对该协议如何影响振荡和认知的完全理解。在结束之前，应该注意到这项研究的其他一般性限制，以帮助今后在这一研究方向上的调查。首先，关于我们的刺激方案，谨慎的做法可能是在其他频率，甚至非节律频率下检查TAC rTM的组合，以便明确地将结果与特定脑振荡的变化联系起来，而不仅仅是更大的刺激剂量的结果。其次，虽然我们在rTMS TACS 6×80 CF方案的两个实验中都观察到了效果，但不明显的是，这些效果是由两种刺激方式与TACS的交叉频率刺激相互作用驱动的，还是由交叉频率(6×80 Hz)TACS单独驱动的，这在本研究中没有进行测试。因此，未来的研究还应将结果与仅有TACS的6×80 CF协议进行比较。最后，我们在静息状态实验中观察到了适度的个体间变异性(图4)。可能的差异来源可能包括个体固有的“峰值”振荡频率的异质性，这可能会影响对外部节律刺激的反应。未来的研究可能会使用更大的样本量来调查和控制这种变异性的来源。综上所述，我们观察到6赫兹的相位同步刺激在区域和网络水平上都能导致6赫兹振荡的诱导和稳定，并且还能产生独立于个体θ频率的功能效应。这些发现为通过直接调节振荡活动来探索认知过程的研究提供了一种新的方法，并为临床翻译调节病理振荡提供了一个前景。
参考文献：Phase synchronized 6 Hz transcranial electric and magnetic stimulation boosts frontal theta activity and enhances working memory
