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一、什么是RPKM、 FPKM、TPM、CPM
RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!! 对基因counts进行校正定量一般有RPKM、FPKM 、TPM和CPM这几种方法,StatQuest网站中对RPKM, FPKM 和 TPM作了通俗简要的说明,现将其核心要点整理如下:
RPKM
RPKM (Reads Per Kilobase Million, or Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped) 每千个碱基的转录每百万映射读取的reads
计算RPKM的方法:
- 计算样本中的总reads,并将该数字除以1,000,000——这是我们的“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor ) 。
- 将reads数除以“每百万”缩放因子。消除测序深度影响,得到每百万reads(RPM, reads per million )
- 将RPM值除以基因长度(以千碱基为单位),消除基因长度影响,得到RPKM。
FPKM
FPKM (Fragments Per Kilobase Million, or Fragments Per Kilobase of transcript per Million reads mapped) 每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments
FPKM与RPKM非常相似。RPKM是针对单端测序的RNA-seq而言的,其中每个reads对应于一个已测序的单个片段。FPKM用于双端测序的RNA-seq。使用双端测序RNA-seq,两个reads可以对应一个片段(Fragment)。RPKM和FPKM之间的唯一区别是FPKM考虑到两次reads可以映射到一个片段(因此它不会对该片段进行两次计数)。 即 单端测序:reads=fragments,双端测序:2 * reads≈fragments 而经过上游处理,双端测序两个reads可以对应一个片段的过程已经完成,最后得到的counts就已经相当于是片段fragments了,因此下游分析由counts计算RPKM、 FPKM这两者的公式完全一致。
TPM
TPM (Transcripts Per Million, or Transcripts Per kilobase of exon model per Million mapped reads) 每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts
计算TPM的方法:
- 将读数计数除以每个基因的长度(以千碱基为单位),得到每千碱基reads(RPK, reads per kilobase)。
- 计算样本中所有RPK值,然后将其除以1,000,000,得到“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor )。
- 将RPK值除以“每百万”缩放因子,得到TPM。
因此在计算TPM时,与RPKM、 FPKM相比,唯一的区别是TPM先对基因长度进行标准化,然后对测序深度进行标准化。但是,这种差异的影响非常深远。因为使用TPM时,每个样本中所有TPM的总和是相同的,这样可以更轻松地比较每个样本中映射到基因的读数的比例。相反,使用RPKM和FPKM,每个样本中的标准化读数之和可能会有所不同,这使得直接比较样本变得更加困难。
CPM
CPM(Counts Per Million, or Counts of exon model Per Million mapped reads) 每百万映射读取的counts
除了RPKM、 FPKM、TPM这几种方法,CPM也是较为常见的一种基因定量方式。原始的表达量除以该样本表达量的总和,再乘以一百万,即可得到CPM值。CPM值只对测序深度进行了标准化,一般利用edgeR包的cpm()函数即可对基因counts进行简单校正 。 edgeR::cpm(counts)
二、由Counts计算FPKM/RPKM和TPM
有许多文章已经给出了这几种计数方式的计算和转化关系,如What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)。
代码语言:javascript复制countToTpm <- function(counts, effLen)
{
rate <- log(counts) - log(effLen) denom <- log(sum(exp(rate))) exp(rate - denom log(1e6))
}
countToFpkm <- function(counts, effLen) {
N <- sum(counts) exp( log(counts) log(1e9) - log(effLen) - log(N) )
}
fpkmToTpm <- function(fpkm) {
exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) log(1e6))
}
countToEffCounts <- function(counts, len, effLen) {
counts * (len / effLen)
}
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# An example
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cnts <- c(4250, 3300, 200, 1750, 50, 0)
lens <- c(900, 1020, 2000, 770, 3000, 1777)
countDf <- data.frame(count = cnts, length = lens)
# assume a mean(FLD) = 203.7
countDf$effLength <- countDf$length - 203.7 1
countDf$tpm <- with(countDf, countToTpm(count, effLength))
countDf$fpkm <- with(countDf, countToFpkm(count, effLength))
with(countDf, all.equal(tpm, fpkmToTpm(fpkm)))
countDf$effCounts <- with(countDf, countToEffCounts(count, length, effLength))
为了更清楚直观地明白FPKM/RPKM和TPM的计算过程,根据StatQuest定义给出的计算方法,自己重新写了由counts转化为FPKM/RPKM和TPM的计算公式代码,经过验证其结果与上面公式所得结果一致,那今后就用自己写的这些代码吧,具体代码如下:
代码语言:javascript复制#TPM (Transcripts Per Kilobase Million) 每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts
counts2TPM <- function(count=count, efflength=efflen){
RPK <- count/(efflength/1000) #每千碱基reads (reads per kilobase) 长度标准化
PMSC_rpk <- sum(RPK)/1e6 #RPK的每百万缩放因子 (“per million” scaling factor ) 深度标准化
RPK/PMSC_rpk
}
#FPKM/RPKM (Fragments/Reads Per Kilobase Million ) 每千个碱基的转录每百万映射读取的Fragments/reads
#RPKM与FPKM分别针对单端与双端测序而言,计算公式是一样的
counts2FPKM <- function(count=count, efflength=efflen){
PMSC_counts <- sum(count)/1e6 #counts的每百万缩放因子 (“per million” scaling factor) 深度标准化
FPM <- count/PMSC_counts #每百万reads/Fragments (Reads/Fragments Per Million) 长度标准化
FPM/(efflength/1000)
}
#FPKM与TPM的转化
FPKM2TPM <- function(fpkm){
fpkm/sum(fpkm)*1e6
}
tpm <- as.data.frame(apply(counts,2,counts2TPM))
colSums(tpm)
fpkm <- as.data.frame(apply(counts,2,counts2FPKM))
colSums(fpkm)
tpm0 <- as.data.frame(apply(counts,2,FPKM2TPM))
colSums(tpm0)
要注意一点的是计算FPKM/RPKM和TPM时,基因长度一般指的都是基因的有效长度effective length,即该基因的外显子总长度或转录本总长度,以此为标准来消除测序造成的基因长度影响才更为准确。
关于如何得到基因有效长度,请参阅文章:获取基因有效长度的N种方法。
参考资料:RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)RPKM、FPKM、TPM详解RNA-seq的counts值,RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同 - 云 社区 - 腾讯云 (tencent.com)