前言
题目：Decoding the multicellular ecosystem of lung adenocarcinoma manifested as pulmonary subsolid nodules by single-cell RNA sequencing 日期：2021.01.27 期刊：SCIENCE ADVANCES DOI：https://doi.org/10.1126/sciadv.abd9738
摘要
低剂量计算机断层扫描 (LDCT) 筛查的应用显著提高了早期肺腺癌 (LUAD) 的检出率，表现为放射性亚实性结节 (SSN)。亚实性结节的肺腺癌 (LUAD) 表现出比实性 LUAD 更惰性的生物学行为，比如之前发现 SSN 的基因组具有相对较低的突变负荷和很少的拷贝数改变。肿瘤病变是由恶性细胞、各种类型的免疫细胞和基质细胞组成的复杂生态系统，因此解码 SSN 中肿瘤细胞与 TME 之间复杂的相互作用至关重要。
该研究对 16 个表现为 SSN 的 LUAD 样本进行了单细胞 RNA 测序，将 SSN 与 9 个有淋巴结转移的原发性 LUAD 样本（mLUAD）和 6 个相邻正常肺组织（nLung）样本进行比较，全面展示了 SSN 的恶性细胞、免疫细胞和基质细胞的转录组特征。
SSN多细胞生态的单细胞转录组分析
对来自 16 名初治患者的总共 16 个 SSN 样本进行了单细胞转录组测序，同时下载了 9 个 mLUAD 和 6 个 nLung的scRNA数据。总共得到118,293 个细胞，其中70,461 个细胞（59.56%）来自 SSN，26,344 个细胞（22.27%）来自 mLUAD，21,488 个细胞（18.17%）来自 nLung。
降维聚类后得到26 个clusters，确定了 10 种主要细胞类型：T 细胞、自然杀伤 (NK) 细胞、骨髓细胞、B 细胞、浆细胞、肥大细胞、成纤维细胞、内皮细胞 (EC)、EPCAM 上皮细胞和成红细胞。
T 细胞的相对丰度从 nLung 到 SSN 和 mLUAD 逐步增加。SSN 中 NK 细胞的相对丰度与 nLung 相当，但高于 mLUAD。此外，肥大细胞在 SSN 中显著富集。在 SSN 和 mLUAD 中，与 nLung 相比，单核吞噬细胞的相对丰度降低，而 B 细胞和浆细胞的相对丰度增加。
说明SSN 代表了一个不同于 nLung 和 mLUAD 的多细胞生态系统。
SSN恶性细胞的标志性特征
这里作者要研究每种主要细胞类型的转录组学特征。从 nLung 样本中获得总共 1997 个正常上皮细胞，并进一步聚集为肺泡 I 型细胞 (AT1; AGER )、肺泡 II 型细胞 (AT2; SFTPA1 )、分泌性club细胞 (Club; SCGB1A1)、基底气道上皮细胞（Basal；KRT17）和纤毛气道上皮细胞（Ciliated；TPPP3）
通过CNV来鉴定恶性细胞，发现恶性细胞和患者来源有关，表明肿瘤间存在高度异质性。
比较 mLUAD 与 SSN 的基因组变异分析 (GSVA)，发现E2F 靶标、MYC 靶标、干扰素-α (IFN-α) 和 IFN-γ 反应以及 PI3K-AKT 和缺氧途径被上调在 mLUAD 中的恶性细胞中。SSN 与 nLung 的比较显示，许多代谢途径在 SSN 的恶性细胞中显著上调——包括糖酵解；氧化磷酸化；和脂肪酸、异源物质和血红素代谢。
对代谢谱的进一步全面剖析 表明 SSN 中的恶性细胞具有不同的代谢模式。一些代谢途径在 SSN 恶性细胞中高表达，包括氧化磷酸化；精氨酸和脯氨酸代谢；组氨酸代谢；和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢。
最后，使用非负矩阵分解探索了来自 SSN 和 mLUAD 样本的恶性细胞中表达的差异。分层聚类确定了在 mLUAD 中变化的五种常见表达通路：包括细胞周期、线粒体信号传导、上皮-间质转化 (EMT)、上皮分化和缺氧。在 SSN 中，恶性细胞表现出强烈的代谢重编程和免疫应激。
SSN 的 Cytotoxic dominant T和 NK 细胞
57,301 个 T 细胞和 NK 细胞进行亚聚类显示了 12 个亚型：
- 5 subtypes of CD4 T cells (CD4-C1 to C5; CD3D CD4 ) including 1 regulatory CD4 T cell subtype (CD4-C4; FOXP3 )
- 5 subtypes of CD8 T cells (CD8-C1 to C5; CD3D CD8A )
- 2 subtypes of NK cells (NK-C1 and C2, CD3D− CD56 TYROBP ) 从SSN获得了35,185个T/NK细胞
对于 CD4 T 细胞，得到了
- 记忆 (CD4-C1; ANXA1 )、
- 效应记忆 (CD4-C2; ANXA1 GZMA )、
- naive T (CD4-C3; CCR7 SELL LEF1 )、
- reg T (CD4-C4 ; FOXP3 IL2RA )，
- exhausted (CD4-C5; CXCL13 PDCD1 BTLA TOX ) CD4 T 细胞 。
在 SSN 中，效应 CD4 T (CD4-C2) 的百分比与 nLung 相比降低，但高于 mLUAD，而抑制性调节因子 (CD4-C4) 和耗尽 CD4 T 的百分比 ( SSN 中的 CD4-C5) 细胞与 nLung 中的细胞相当，但明显低于 mLUAD 中的细胞。
对于CD8 T 细胞，GZMK高表达但其他细胞毒性效应物低表达的CD8-C1 代表前效应CD8 T 细胞。与CD8-C3细胞相比，CD8-C5细胞表现出更高的增殖基因表达水平，例如MKI67。TCGA数据显示，CD8-C3 和 CD8-C5 细胞的特征基因的高表达水平都与 LUAD 患者的较差预后相关。
与 NK-C2相比，与 NK-C1细胞的特征在于FCGR3A（CD16 ）表达，并且代表了最具细胞毒性的细胞群。SSN 中 NK 细胞的百分比与 nLung 中的接近，与 mLUAD 相比，SSN 中的 NK-C1 细胞富集。
SSN 的内皮细胞亚型与 mLUAD 相似
3381 个 内皮细胞聚类揭示了六个亚型：
- 肺泡外毛细血管 EC (cEC) (Endo-C1；EDN1 SLC6A4 ，Endo-C5 ; EDN1 CCL2 )、
- 肺泡 cECs (Endo-C2; EDNRB IL1RL1 )、
- 肿瘤 ECs (Endo-C3; IGFBP7 PLVAP )、
- 动脉 ECs (Endo-C4; GJA5 FBLN5 )
- 淋巴 ECs ( Endo-C6；PDPN CCL21 )。
SSN 和 mLUAD 具有相似的内皮细胞亚型分布，其特征是 Endo-C3 增加和 Endo-C5减少
Endo-C5 细胞富含免疫激活相关通路[炎症反应、肿瘤坏死因子-α (TNFA) 信号通路和 IFN-γ 反应]，而 Endo-C3 细胞富含生物合成和代谢与血管生成和细胞外重塑相关的途径。与 mLUAD 相比，Endo-C2 细胞在 SSN 中含量丰富、
SSN涉及的细胞通讯
研究 SSN 中的细胞间相互作用，是基于配体-受体信号传导，从而推断出假定的细胞间相互作用。如果一个细胞表达受体或配体，则这种“配体-受体”相互作用分别定义为该细胞的传入或传出 。
与 nLung 相比，SSN 和 mLUAD 中的 ECs 和巨噬细胞具有更多的外向相互作用，而 CD8 T 细胞具有更多的内向相互作用。值得注意的是，NK 细胞、CD8 T 细胞和 CD4 SSN 中的 T 细胞比 nLung 和 mLUAD 中的 T 细胞具有更多的传入相互作用，这些传入连接主要来自成纤维细胞、单核细胞、ECs 和巨噬细胞。
与 mLUAD 和 nLung 中的 NK 细胞相比，SSN 具有更多的相互作用。其中有两种高表达受体：CXCR4和CX3CR1。CXCR4的配体是CXCL12，由成纤维细胞和ECs表达。CX3CR1的唯一配体CX3CL1的高表达主要在SSN的Endo-C2和Endo-C5细胞中。
另外，与细胞外基质重塑和 EMT（胶原整合素、TGF7-NRP1、CXCL12/TGFB1-CXCR4和CSF1-CSFR1）相关的相互作用在 mLUAD 中更为丰富。与 nLung 相比，SSN 和 mLUAD 中与血管生成信号相关的相互作用更强，与 mLUAD 相比，SSN 中与淋巴细胞募集的相互作用（HAS2/MMP7-CD44和ICAM1/2-integrins）更强。
