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标题:Extracellular vesicles from lung tissue drive bone marrow neutrophil recruitment in inflammation 期刊:J Extracell Vesicles 日期:2022.5.20 DOI: https://doi.org/10.1002/jev2.12223 作者及单位:Yuxin Yin,北京大学健康科学中心基础医学科学学院系统生物医学研究所
细胞外囊泡(EVs)是一种单膜囊泡,在远距离的细胞间通信中发挥重要作用。EVs的研究主要通过细胞培养系统进行了探索,但目前尚不清楚生理EV如何在体内发挥稳态或病理功能。在这里,我们报道了肺EVs通过传递双链DNA(dsDNA)促进骨髓中中性粒细胞的趋化。
数据情况
- 肺组织的单细胞数据来自GEO数据库:GSE133747 provided scRNA-seq data of lung cells from human and mouse。使用了 这个数据集中的female mouse lung sample和所有human lung sample。分析:“Seurat” package (v 3.0),数据整合The “FindIntegrationAnchors” function 和 the “IntegrateData” function。
- human and mouse lung EV proteins数据:LC–MS/MS data,过滤标准:
- (1) the protein was simultaneously detectable in all samples (six samples for human and three samples for mouse);
- (2) the average peak area of the protein was greater than a certain value
- 最终有583 human proteins and 589 mouse proteins用于后续分析
数据主要分为免疫细胞与非免疫细胞两大群:
- In human lung clusters, monocytes, T cells, macrophages, NK cells, DCs, B cells and mast cells were designated as immune cells, whereas other types of cells were designated as non-immune cells.
- In mouse lung clusters, B cells, T cells, macrophages, monocytes, NK cells, neutrophils and DCs were designated as immune cells, whereas other types of cells were designated as non-immune cells
肺组织EVs蛋白与单细胞Cluster交集情况:identified as “Cluster Markers”, “Non-Cluster Markers” or “Not detected” (Supplementary Tables 1 and 2).
结果
1.肺组织EVs的分离与鉴定
使用透射电镜(TEM)观察到了正常肺组织中存在的各种EVs和MVEs
为了从正常肺组织中收集高质量的 EVs,我们开发并优化了一种基于差异离心的方案,如图所示:
在小鼠样本中,EVs相关蛋白(ALIX、TSG101、CD9、CD81)在110,000×g颗粒(P110kg)中高度富集,而高尔基体(GM130)、内质网(Calnexin)和线粒体蛋白(TOM20、VDAC1)在P110kg部分中检测不到或仅微弱存在。
EV标记蛋白在人类样本P110kg部分的类似富集。
透射电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和低温电子断层扫描显示,人类和小鼠组织中P110kg部分中囊泡的形态和大小分布相似。
上面提到的几种实验都是鉴定样本中是否存在EVs的常用技术:透射电镜(TEM),纳米颗粒跟踪分析(NTA),Marker蛋白印迹法
2.人和小鼠肺EVs的蛋白质组学分析
采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析了从6个人和3个小鼠肺样本中分离的EVs蛋白成分。为了评估来自不同来源的蛋白质组之间的总体相关性,我们比较了不同类型的样本类型(即肺细胞与肺EVs)和物种(即人类EVs与小鼠EVs)。
- 与肺组织细胞相比,肺EVs显示出不同的蛋白谱:除了经典的EV标记物(CD9、CD81)外,还鉴定了肺特异性EV标记物(GPRC5A、AGER)
- 与EVs中的典型蛋白相比,在肺细胞中检测到位于细胞骨架(如TUBB、ACTN1和LCP1)和细胞质(如arhgdib、CNDP2和PGD)上的蛋白水平更高
- 人类和小鼠肺EVs的蛋白质组相似,检测到的超过一半的蛋白质是共享的
FIGURE2 Protein profiling proves vesicle- and tissue-specificity of lung EVs
3.GPRC5A和AGER被鉴定为肺EVs标记物,这也证实了分离的EV的组织来源
4.ATII是肺EVs的主要来源
多种哺乳动物细胞都能够释放EVs,而EVs的分子组成可以反映出它们的原始细胞,而scRNA-seq是一种解剖器官和组织复杂性的强大技术,有助于我们了解细胞多样性和异质性转录表型状态的基础。我们试图利用公共scRNA-seq数据和我们的LC-MS/MS结果来确定EVs的来源,遵循如图所示的过程:
简单地说,在获得了肺细胞的scRNA-seq数据和肺EVs的蛋白质组学数据后,我们评估了肺EVs的蛋白质组成是否能反映其细胞来源。
由于EVs中超过一半的蛋白质在特定的细胞类型中表达,我们根据每个细胞簇的丰度(来自LC-MS/MS数据)和表达水平(来自scRNA-seq数据)计算了每个细胞簇中EVs的比例。最后,我们计算了单细胞释放EVs的能力。
单细胞聚类结果:
来自17,370个人类细胞的15个界限明确的簇和来自3989个小鼠肺细胞的16个簇,包括在肺中发现的常见免疫细胞和非免疫细胞。
我们从人类(补充表1)中选择了583个高丰度EV蛋白,从小鼠(补充表2)中选择了589个,并生成了热图,显示编码EV蛋白的基因在不同的簇中具有不同的表达水平。
这些EVs蛋白在单细胞cluster gene中的情况:至少有一半以上都与细胞特异性高表达基因overlap,表明蛋白质在scRNA-seq数据中的一个或多个聚类中特异性表达。
这些结果表明,肺EVs中的蛋白质可以反映其细胞来源,这对后续的分析具有重要意义。
对scRNA-seq和LC-MS/MS数据的综合分析表明,ATIIs可以占大部分EVs,表明ATIIs是肺组织EVs的主要来源:
图中百分比计算方式:
然后使用蛋白质谱分析来评估单个细胞释放EVs的个体能力。对于人类样本,我们发现单个成纤维细胞释放的EVs最多(图3e),而ATI细胞从小鼠样本中释放的EVs最多(图3f)。
与单个免疫细胞相比,从单个非免疫细胞中获得了更多的 EVs:
对多种人和小鼠细胞系培养上清液中 EVs的定量分析显示了相似的结果。
GSEA分析显示:与所有免疫细胞相比,所有非免疫细胞中EVs分泌相关基因均显著富集(图3j)。EVs分泌相关基因在非免疫细胞中的表达上调与它们释放EV的能力高于免疫细胞的能力相一致
上述结果表明,我们的分离和高通量检测方法已确定ATII细胞是肺EVs的主要来源,非免疫细胞通常比免疫细胞释放更多的ev(每个细胞)。
那确定了EVs的来源细胞,它的目的地在哪里呢(受体细胞)?
接下来的问题:搭载了EVs这个通讯工具的cargos(蛋白质)要运往何处?
EVs通过细胞和器官之间传递货物,导致受体细胞的改变。为了探索肺EVs的生物学功能,我们首先研究了它们的积累位置。
实验设计:
为了评估小鼠肺EVs在小鼠体内的生物分布,将DiR标记的肺EVs通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内;以DiR标记的脂质体作为对照。然后使用体内成像系统对这些动物进行检查。
结果:
- 我们发现,与注射脂质体的对照组小鼠相比,注射肺EVs的小鼠的下肢显示出高荧光信号
- 流式细胞术分析证实了这些结果,与对照组小鼠相比,在注射了DiI标记的EVs的小鼠骨髓中检测到更多的红色荧光
- 然后,我们研究了不同的给药途径对肺EVs分布的影响,即尾静脉注射、腹腔注射和鼻内灌注:结果表明,不同途径不影响肺EVs在骨髓的积累,与其他两种途径相比,骨髓中静脉注射检测到更多的红色荧光细胞,说明肺EVs通过血管转移,与预期一致
- 使用双光子激光扫描显微镜对小鼠肺组织进行活体成像,我们还在鼻内灌注dii标记的EVs 24小时后,在血管内空间观察到红色荧光标记的EVs(补充图5a),支持了肺EVs进入血管的结论。
- 骨髓中的红色荧光细胞随后被鉴定为主要为中性粒细胞(52.7%)和单核细胞(24.1%)
- 利用共聚焦显微镜,我们观察到用红色荧光标记的肺EVs与中性粒细胞共定位,这些中性粒细胞被鉴定为CD45 Ly6G 细胞(Ly6G - a marker for monocytes, granulocytes and neutrophils:https://www.novusbio.com/antibody-news/antibodies/ly6g-a-marker-for-monocytes-granulocytes-and-neutrophils)
- 此外,作者还进行了体内实验验证肺EVs可以转移到骨髓中性粒细胞(下图F)
以上结果表明,肺EVs转移到骨髓中性粒细胞是通过血管发生的
EVs通讯的几大关键问题与挑战不知大家还记得与否:外泌体多组学05-EV介导的细胞间通讯研究综述
第一个非常重要的是:来源细胞与受体细胞的确定,此篇文章做了很多研究工作,结合了组织外泌体与单细胞技术完美揭示这个问题!
第二个问题:EVs被运到受体细胞后,会对受体细胞产生什么样的影响呢?(比如进入受体细胞的通路机制,在受体细胞内发挥作用的通路机制)
实验设计:
mRNA sequencing analysis:肺EVs刺激的中性粒细胞 vs untreated 中性粒细胞
结果:
- 差异分析与GSEA:相对于对照组,促炎趋化因子的转录水平在肺EVs刺激的中性粒细胞显著上调
这表明:肺EVs可促进中性粒细胞趋化
根据作者强大的生物背景知识:已知CXCL1和CXCL2有助于急性炎症过程中中性粒细胞动员和招募的早期阶段。
作者前面还对肺EVs做了一个全基因组测序,并将EVs中的 dsDNA引入了 EVs在受体细胞内发挥作用的通路机制解释中(我并不关注EVs中DNA层面的分析,感兴趣的可以去文章看详细内容),最后的通路机制如下:
我在此有个很大的疑问啊:所以EVs中的货物蛋白质在这里只是做了一个溯源?它对受体细胞就没有影响吗?即使作者说了EV衍生的DNA可以通过旁分泌的相互作用来调节肿瘤免疫。