空间转录组（ST）和单细胞转录组（scRNA-seq）的结合作为一个关键的组成部分，将人体组织的病理表征与分子改变联系起来，确定了原位细胞间的分子通讯和时空分子医学知识。2022年4月1日Nature子刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》发表综述文章，概述了ST实验和生物信息学方法的发展，并评估了其临床和转化应用价值。
空间分辨转录组学技术
ST为理解胚胎发育过程和定义特定发育器官、早期定位和迁移的关键基因提供了新的见解。与scRNA-seq相比，ST能更好地观察发育的细胞谱系中的细胞位置和异质性。在ST技术的发展中，代表技术包括ProximID、seqFISH 、Stereo-seq、sci-Space、STARmap、10×Genomics Visium、Slide-seqV2、Seq-Scope等。
图1 空间转录组技术的发展文中描述了以下基于不同原理的ST技术，包括TIVA、FISSEQ、seqFISH、LCM、APEX-seq、NICHE-seq、LCM、APEX-seq、NICHE-seq、HDST和DBiT-seq。
图2 基于不同原理的空间转录组学检测技术流程空间转录组的生物信息学工具
ST的代表性生物信息学工具
ST的代表性在线资源与scRNA-seq聚类方法相比，ST需要对基因表达、空间位置和组织学信息进行更全面和综合的考虑。ST的一个关键分析步骤是对斑点进行聚类，并确定基因表达谱和形态表型在空间上一致的区域。空间聚类方法分析基因表达的空间相关性，主要包括SpaCell、SpatialCPie、ClusterMap、FICT、SpaRTaCo、SC-MEB和CCST。
空间变异基因（SVG）的识别对于确定细胞类型的位置非常重要。随着ST分辨率的提高，已开发新的方法来检测空间可变基因，例如GLISS、SpatialDE、SOMDE、trendsceek或SPADE。
在ST数据分析中，可以利用scRNA-seq数据推断出每个点的细胞类型分布。为分析空间数据设计了多种细胞类型去卷积方法，如SPOTlight、spatialDWLS、DSTG、DestVI或STRIDE和RCTD。
对于缺乏单细胞分辨率的ST数据，每个点可能包含不同的细胞类型。通过参考邻近斑点的信息或具有细胞形态和表型的高分辨率信息的图像，可以提高分析的质量。提高基因表达分辨率的工具包括BayesSpace和XFuse。
细胞-细胞通讯调节各种生物过程，以维持器官/组织内细胞的生物功能和微环境稳态。配体-受体对用于探索组织内不同细胞类型之间以及同一细胞类型内不同细胞之间的scRNA-seq通信，而ST则提供空间水平上的细胞间通信信息。已开发了许多工具来识别细胞间通信，包括GCNG和SVCA。
ST在发育和疾病方面的应用潜力
ST主要用于揭示人和小鼠在神经科学、胚胎发育和病理学领域的细胞连接的全面信息、不同细胞类型之间的复杂调控网络、细胞异质性和微环境稳态。此外，在斑马鱼、红原鸡、野猪、仓鼠和果蝇中绘制了一些组织的ST图谱。
图3跨多个物种的代表性空间转录组学研究ST被广泛用于分析组织的分子空间结构，并在临床和生物学研究中创建生物分子图谱。例如使用Slide-seq技术，以单细胞分辨率捕获并生成小鼠和人类受试者的空间基因表达模式。STARmap分析了3D大脑空间的复杂性，在小鼠初级视觉皮层的30000多个细胞中使用了23个细胞类型标记。生物体的胚胎发育是一个复杂而动态的过程，其中的表达图谱和分布由ST绘制。
ST的另一个重要应用是研究肿瘤内的异质性，以精确了解肿瘤进展和治疗结果。例如通过分析邻近肿瘤区域间质肿瘤微环境中的基因表达梯度，对前列腺癌的肿瘤异质性进行重新分层。通过淋巴结活检对黑色素瘤中近2200个组织结构域的转录组进行研究，以可视化组织内的转录景观，并确定特定组织区域的基因表达谱。ST结合机器学习从乳腺癌ST数据中识别诊断生物标志物，以区分导管原位癌和浸润性导管癌。导管癌的预测准确率为95%，浸润性导管癌的预测准确率为91%。最近的ST保留了组织结构，并通过分析细胞间的相互作用反映了免疫反应。在靶向治疗期间，癌症患者需要快速准确地识别耐药克隆和空间敏感生物标记物，以预测对免疫治疗的反应。ST将为早期检测组织内的基因表达和细胞相互作用提供机会，但是精确肿瘤学中细胞的精确分辨率和灵敏性需要进一步提高。
图4 空间转录组学技术主要用于解决疾病的空间异质性、生物空间转录组图谱、胚胎发育空间图谱等
人类样本的代表性ST研究
图5 空间转录组学为理解人类疾病的分子机制和临床前疾病模型提供了新的见解
神经病学中的ST
神经系统ST为理解单个神经元的类型、位置、树突结构、轴突投射和相应功能提供了新的见解。例如功能失调大脑的ST图谱提供了有关脑细胞类型的发育或退化组织和位置的分子信息，以开发新的分子生物标记物/靶点，并了解脑疾病的新机制。使用Fiji “Analyze particles”插件和ST流程进行数据处理，使用具有分层生成概率模型的ST测量ALS患者的小鼠脊髓和死后组织的基因表达，区分早期小胶质细胞和星形胶质细胞之间的区域差异，并确定ALS模型和患者脊髓病理学之间转录途径的干扰。在ALS诱导后，小鼠体内动态发现约11138个基因的空间分布，并从ALS患者的脊髓样本中进一步发现9624个基因。这项特别的研究定义了基因表达在组织中的明确定位和多维分布，并描述了退行性疾病的新机制（图5a,b）。
ST和scRNA-seq的结合是一种新的方法，可以动态和多维度地了解疾病的分子机制，并开发新类别的空间生物标志物。该组合被推荐为诊断疾病、监测疾病进展和治疗效果，以及发现新类别的空间靶点药物的有效途径。这种结合可以描述血管海绵状瘤中脑内皮细胞的转录多样性和亚类，并确定在脑海绵状畸形发展中的功能作用。最初发现血管生成性静脉毛细血管内皮细胞和常驻内皮祖细胞可能是脑海绵状畸形转化的主要来源，而不是动脉内皮细胞。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种破坏性的神经系统疾病，逐渐丧失智力、认知和身体功能。从小鼠切片的ST图谱中识别出AD相关基因，包括与应激反应和线粒体功能障碍相关的空间失调基因。在AD模型中，ST在早期淀粉样斑块周围直径为100微米的组织切片中显示了富含髓鞘和少突胶质细胞基因的共表达网络的转录变化，而在晚期，在补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症中显示了共表达网络的转录变化。通过无偏识别的空间定义特征和ST脑区分子图谱可以解释成年小鼠大脑回路和行为的结构-功能关系以及系统分类。对不同脑区空间基因的注释为理解神经元结构、神经连接、中间神经元投射、突触前和神经胶质相互作用提供了新的见解。成年小鼠大脑区域的空间组织包括用于映射和定位离散神经解剖区域的分子代码。
胚胎发育中的ST
胚胎和干细胞谱系是探索组织模式和相应分子调控回路的范例。带有scRNA-seq的ST为剖析胚胎发育过程中细胞组织的分子动力学、形态学和分子特性的差异以及谱系分配开辟了新的途径。利用ST和scRNA-seq技术，对小鼠原肠胚植入后胚胎和发育的关键特征进行了体细胞发生过程的探索。人类胚胎心脏细胞类型及其分布和空间组织的综合转录图谱揭示了4.5~5周、6.5周和9周后的三个发育阶段。使用Seurat软件包进行数据处理，三个人类胚胎心脏样本的ST图谱显示了人类胚胎心脏发育过程中约3115个个体点和10个心肌簇。从大约69个选定的靶基因中获得了细胞类型、转录组和人类心脏发育的时空图谱。通过结合ST、scRNA-seq和GO分析，它能够更好地识别组织中每种细胞类型（图6a）、心脏细胞类型特异性基因和相互作用网络（图6b）的位置分布和基因标记。通过使用10×Genomics Visium和Space Ranger软件，ST结合scRNA-seq展示了人类肠道发育和形态发生的时空图谱。在这项特别的研究中，从代表不同发育时间点和组织位置的17个胚胎中收集了77个肠道样本，并根据关键标记基因的精细聚类注释在隔室中确定了101个亚组。转录调控网络的定位和示例如图6c所示，以突出显示每种细胞类型的关键调控网络，并使用scRNA-seq重建细胞命运的“决策树”，包括已知的发育调控因子、306个发育时程和44个调控网络的位置变化。对整个肠道发育过程中的组织进行ST分析（图6c），发现了scRNA-seq识别簇的时空位置、上皮隐窝绒毛的形成、间充质的分化、肌肉层的建立、血管系统的扩张、免疫定植和肠道相关淋巴组织的出现。每种类型的细胞都有特定的基因标记，其中一些在基因表达（图6c）、肠细胞类型特定基因和相互作用网络（图6d）方面存在位置和时间点差异。这项特殊研究的杰出发现为理解新生儿疾病和肠道发育的遗传缺陷提供了新的见解。
图6 ST与scRNA-seq提出新的细胞类型和人类胚胎发育的分子标记 病理学中的ST
ST特征的3D图像显示了肿瘤和免疫细胞之间相互作用的异质性，以及浸润的免疫细胞在不同位置的差异。使用机器学习模型，肿瘤和免疫相互作用的分析、描述和分层能力得到了高精度的提高。黑色素瘤淋巴结活检的ST图谱揭示了与组织学实体相关的肿瘤内空间成分的转录景观和基因表达谱的异质性。靠近肿瘤区域的淋巴区的基因表达模式与肿瘤微环境相似。转录组图谱的空间定位有助于我们了解肿瘤进展、转移的分子机制，并确定治疗靶点。牙周组织的ST图谱显示，炎症区域特异性极性阴影的表达上调，这是慢性炎症性牙周炎发病机制的一部分。成人心脏ST图谱显示心力衰竭患者胎儿基因表达的空间差异。
肿瘤内部和肿瘤之间的异质性与肿瘤亚克隆的扩展、基因的改变和肿瘤细胞在肿瘤微环境中的相互作用高度相关，并与肿瘤的进展和复杂性有关。绘制了各种疾病的ST图谱，包括脑组织、脊髓组织、乳腺癌、皮肤恶性黑色素瘤、前列腺癌、牙龈组织、胰腺组织和人类心脏组织。图5c,d,e,f分别展示了ST结合scRNA-seq等组合的方式应用于原发性胰腺导管腺癌、人类皮肤鳞状细胞癌、前列腺癌、皮肤恶性黑色素瘤研究。
空间转录组在分析感染性疾病的发病机制中具有重要的应用价值。scRNA-seq与不同时间点的新生小鼠回肠和心脏组织的ST相结合，揭示了心肌炎感染发病的动态过程，不同细胞表型的空间异质性网络，以及与病毒引起的细胞间相互作用的关系。
时空多组学和跨组学将为理解该疾病提供更重要和全面的见解。需要更多的措施来定义表达的靶蛋白的定量、时空定位、突变、剪接异构体和翻译后修饰变异。由于样品制备、质量控制、数据生成和解释过程复杂，或成本高昂，时空技术在临床上的应用仍然滞后。应进一步开发方法的新颖性和标准化，例如提高通量（每次实验捕获的斑点或细胞数量）和提高分辨率（每个细胞检测到的基因数量）。空间跨组学是ST发展的一个新方向，需要在一个样本中同时检测染色体结构、染色质可及性、组蛋白修饰、DNA甲基化、转录组、蛋白质组、代谢和非编码RNA。基于云计算和人工智能的工具将使科学家能够轻松、自由地解释复杂的时空数据。随着测序方法、文库构建方案和化学试剂的快速发展，成本将降低，有效地使时空分子病理学成为临床筛选、诊断和治疗监测的候选方法。
炎症性疾病中的ST
根据外部刺激、发育方向、肿瘤转移阶段和肿瘤微环境中的“界面”细胞状态，组织中细胞簇和亚型以及相应基因的空间位置或自然状态代表不同的信号浓度梯度。微环境中的空间细胞间通讯提供了有关器官和疾病发展中的生物功能、网络和宿主-病原体相互作用的更详细信息。例如ST描述了慢性炎症性疾病引起的免疫细胞机制和组织多样性，包括在类风湿性关节炎中过度表达CD3E、CXCL9、CXCL13和LTB。而在脊椎关节炎中，POSTN、COMP、CILP2和PRG4与较高的软骨周转率有关。
ST 临床应用的潜在挑战
由于基因表达在生物过程中以复杂的空间形式发生，因此了解疾病发生和发展的空间异质性以及开发用于定义基因/蛋白质/细胞类型和病变组织中精确位置的ST非常重要。精确选择方法是优化呈现疾病特定分子相互作用图谱的关键步骤之一。例如，利用scRNA-seq发现一种疾病相关的小胶质细胞与AD模型中的神经退行性疾病有关，而利用RNA-seq和smFISH确定了人类AD死后大脑中这种小胶质细胞类型在Aβ斑块附近的位置，并与AD的起源密切相关。使用免疫组化染色验证了细胞内Aβ颗粒数量的增加和疾病相关的小胶质细胞标记的阳性。这一发现为开发用于AD靶向治疗的小胶质细胞激活药物提供了一个机会。
ST图谱显示3D分子表型和描述信息，以及表达基因的身份、程度和位置。心力衰竭患者成人心脏活检中胎儿基因的空间表达与胎儿心肌相似。胎儿标记基因的过度表达有助于人类心脏的重塑。根据肝小叶分带中靶基因的空间表达，肝分带是导致血管结构空间异质性和同一性的最重要因素。临床前ST研究表明，在单细胞水平上，缺血神经元体细胞和轴突线粒体之间，以及内毒素血症诱导的急性肾损伤中组织细胞之间存在细胞间通讯和功能障碍。这种基因表达的空间模式有助于我们理解异质性的发生和发展，包括微环境、肿瘤内和肿瘤间、复发、转移和治疗反应（图7）。与scRNA-seq相比，ST图谱提供了基因表达和细胞间相互作用的清晰定位，而两者都属于全面的描述性信息。与scRNA-seq不同，ST为分子机制的提出提供了空间表型的描述信息。
图7 肿瘤微环境模拟图 ST的临床意义和应用高度依赖于ST图谱的匹配性、可重复性和稳定性，以及疾病的复杂性、严重性、分期、病理学和结构准确性。在多细胞基因调控网络的ST图谱中，57个斑块诱导基因在AD模型中逐渐构建了一个调控网络。β-淀粉样斑块的沉积可能在疾病过程中起“触发”或“驱动”作用，部分原因是多细胞协同作用的神经退行性机制。由于动物和人类之间以及模型和疾病之间分子图谱和形态表型的差异，将临床前ST图谱转化为临床价值是一个挑战。
综合分析ST的复杂性和可重复性被视为临床应用的技术限制。越来越多的证据表明，ST是了解人类疾病、监测分子信号和细胞间相互作用的空间异质性以及制定精确医学策略的重要工具。ST分布依赖于组织切片在三维器官/组织中的位置和疾病进展的动态阶段。由于不同水平和方向的组织切片之间存在巨大差异，因此，所选组织切片中ST分布的程度是否代表并涵盖了多维器官的全部景观和变化，这一点受到质疑。来自癌症ST数据的分子特征可以对乳腺癌区域内的转录组相互作用进行分类，并为临床理解和决策提供科学证据和支持。病理学识别和选择的准确性对ST图谱和相应的细胞间相互作用的可靠性和匹配性起着决定性作用。尽管ST图谱在发现和识别疾病特异性和空间化特异性因素方面取得了进展，但构建和绘制空间图谱的综合分析还需要进一步标准化、自动化，并具有大范围ST分析、减少方法学变异和更多潜在探索的特点。由于样本收集、保存和运输的困难，人类样本的数量仍然有限，无法得出明确的结论。迫切需要对目标疾病进行系统、精心设计的临床研究，并提供有关切面位置、疾病阶段和严重程度以及干预措施的明确信息。ST目前影响着我们对组织结构中转录组调控和细胞间相互作用的理解和知识，而ST的长期影响应该通过整合ST与临床表型的临床应用来证明。
随着新ST技术的快速发展，数据采集不断改进，ST分辨率、灵敏度、通量量和可及性方面的挑战正在被克服。ST与石蜡包埋组织相容，为生物库中采集的样本进行回顾性分析提供了可能性。这将有可能系统地检测各种组织并重建生物体的三维空间结构基因表达。改进的ST将使我们进一步了解生物体的发育过程，并为临床医学中的早期疾病检测和精确的靶向治疗提供基础。ST与多种技术的联合应用将需要满足临床需求。因此，相信持续提高ST分辨率和单细胞分辨率的灵敏性将有利于临床实践和改善患者预后。
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参考文献
Zhang, L., Chen, D., Song, D. et al. Clinical and translational values of spatial transcriptomics.Sig Transduct Target Ther 7, 111 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00960-w
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