肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)是一种以运动系统退化为主要特征的疾病，临床证据表明，多达50%的病例出现认知和行为改变。ALS在临床上和生物学上都是异质性(一种遗传性状可以由多个不同的遗传物质改变所引起)的。目前使用临床参数进行亚分组，如症状出现的部位(延髓或脊柱)、疾病负担和家族性疾病患者的基因组学。然而，除基因组学外，这些亚分类没有考虑潜在的疾病病理生物学，不能完全预测疾病的病程或预后。
最近，我们已经证明静息状态脑电图可以可靠和定量地捕捉肌萎缩侧索硬化症中运动和认知网络的异常模式。这些网络中断已在多个频带上被识别出来，并使用对高密度脑电图(EEG)源局部振荡的神经活动(频谱功率)和连通性的测量来识别。使用数据驱动的方法(相似网络融合和频谱聚类)，我们现在进行了聚类分析，以确定疾病亚表型，并确定不同的中断模式是否可以预测疾病的结果。我们发现ALS患者(N=95)可细分为四种具有不同神经生理特征的表型。这些聚类的特征是初级躯体运动皮质(α波段同步)、额颞(β波段神经活动和γ1波段同步)和额顶叶(γ1波段共调制)网络的不同程度的破坏，这些网络可靠地与不同的临床特征和不同的疾病轨迹相关。通过深入的稳定性分析，我们表明这些聚类在统计上具有可重复性和鲁棒性，在使用随访脑电图再次评估后仍保持稳定，并可以预测临床轨迹和疾病结果。本文发表在BRAIN杂志
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1. 介绍
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)是一种异质性的神经退行性疾病，主要影响运动系统，导致不同程度的上、下运动神经元功能障碍，同时累及运动外区域，表现为认知和行为障碍，与额颞叶痴呆(FTD)重叠。肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者在临床表现和预后方面都是异质性的，其潜在的疾病病理生物学也具有可变性。目前的临床表型基于症状发生的主要部位(脊髓、延髓、呼吸道)、家族史和上下运动神经元受累的相对程度(上下运动神经元为主)。此外，ALS患者也通常根据生存期(短、平均和长)进行分类。使用结构和功能MRI、PET和神经生理学(脑电图和肌电图)数据寻找与临床亚组相关的定量测量。
ALS临床表型的其他改进包括行为亚表型的询问、早期临床咨询的数据以确定生存概率范围和基因组特征。至少有30个已确定的基因和三个主要的病理生理过程(如RNA生物学、蛋白质转换和轴突转运)与ALS有关。综上所述，这些观察结果，以及肌萎缩性脊髓侧索硬化症相关基因之间缺乏明确的相关性，以及高度独特的分子神经病理和临床亚型，表明肌萎缩性脊髓侧索硬化症不再被视为具有单一病理生理和临床过程的单一疾病。
目前的影像学和神经生理学证据表明，以生物病理学和遗传因素为基础的神经网络的差异破坏可能反映了异质性的临床表现。使用现有的临床工具，如测量运动功能减退的经修订的ALS功能评定量表(ALSFRS-R)，以及检测认知和行为变化的爱丁堡ALS认知和行为筛查量表(ECAS)，无法完全识别这种差异。
脑电图(EEG)可以在网络水平上为不同的神经退行性疾病相关的功能变化提供额外的见解。使用这种方法与基于任务的范例，我们已经发现了影响额顶网络功能障碍的变化。此外，我们已经证明了静息状态脑电图，它可以提供反映大脑不同过程的不同测量，可以定量地捕捉肌萎缩侧索硬化症影响的运动和认知网络。更具体地说，使用传感器空间分析，我们发现静息状态的脑电图变化与MRI的结构变化相关，并与其他脑电图研究一致。在一项后续研究中，使用先进的源空间分析，我们进一步描述了功能障碍网络，并通过结构MRI和临床数据证实了这一发现。
在这里，我们假设，可以根据网络中断的模式来识别患者亚组，这些模式可以用来揭示对治疗的潜在不同反应。我们展示了脑电图测量活动和大脑网络的连接性如何为形成ALS患者的稳定集群以及与这些患者集群相关的独特的神经生理特征提供信息。
2. 方法
共95例ALS患者:70例脊柱起病，21例患者出现延髓病变和呼吸发病4例，还有77个健康的对照组。5例患者被诊断为ALS-FTD，11例患者C9orf72基因的六核苷酸重复扩增。
实验采集了每个被试3段2分钟的静息态数据，脑电采用128导脑电帽(BioSemi B.V., Amsterdam, The Netherlands)。随后我们在带通(1-97Hz)滤波EEG数据上应用fieldtrip里的线性约束最小方差波束形成器，根据自动解剖标记图谱获得来自90个大脑区域(不包括小脑)的时变信号。利用90个源重构信号，我们估计了归一化谱功率、幅度包络相关和同步(虚相干)。估计每个区域的频谱功率，同时估计每对大脑区域之间的共调制和同步，从而得到90×90对称连接矩阵，其中4005(90×89/2)连接特征是唯一的。这三个测量在六个频段:δ(2-4 Hz)，θ(5-7 Hz)、α(8-13 Hz)、β(14-30 Hz)和γ(γ1: 31-47 Hz，γh: 53-97 Hz)。
在没有预先了解肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者的EEG特征的情况下，我们选择了一种无监督聚类方法并应用于所有可用的EEG特征。首先，使用相似网络融合(SNF)方法组合和制备高维数据集，然后使用频谱聚类。为准备聚类前的数据，对每个EEG特征进行z分数变换。基于欧氏距离构造3个患者相似矩阵(每组EEG特征1个)，采用多个高斯核将其融合为一个相似矩阵。SNF方法使用来自其他矩阵的信息迭代更新每个矩阵，从而融合互补信息。为了消除累积噪声中出现的患者之间的不相关关联，使用网络增强方法对融合的相似性矩阵进行去噪。最后，使用谱聚类对患者进行亚分组。
补充说明：对于这三种EEG测量，使用高斯核构造一个单独的患者相似度(或亲和力)矩阵:
其中
是欧氏距离。
然后，使用相似网络融合(SNF)方法将三个患者相似矩阵(每个患者测了三段)合并为一个，这是一种非线性方法，基于多个获取患者不同特征的数据源创建一个统一的患者视图。
每个参与者都定义了90个“脑电图网络”，这些网络是基于已知的在静息时被激活并在肌萎缩侧索硬化中受到影响的网络。即在6个频带内分别对5个解剖网络(躯体运动网络、额颞网络、额顶叶网络、默认模式网络和突显网络)的谱功率、共调网络和同步网络进行平均，构建90个网络。对于每个组合(即“EEG网络”)，使用AUC(受试者工作特征曲线下的面积)将每个ALS聚类与对照数据进行比较。
获得的AUC值然后用于确定与每个确定的集群强烈且相关的大脑网络。如果脑电网络与对照组相比在统计上显著，与其他组相比其变化独特或方向相反，则认为脑电网络是一个集群的潜在和排他特征。在这里，我们报告了最具特征的脑电图网络受影响的每个集群。
采用运动功能障碍(ALSFRS-R)、认知功能障碍(ECAS)和行为功能障碍(BBI)评分对各亚组的临床特征进行比较。为了评估得到的EEG聚类是否简单地再现了可以直接从临床数据中得到的亚型，我们对N = 60例具有完整临床数据集的患者进行了聚类。
3. 结果
脑电图测量识别四组ALS患者
通过分析脑电图频谱的神经活动和连通性，识别出4个不同的聚类(图1)，四个聚类的解具有较高的统计幂(分别为0.85和0.52)和较大到中等(分别为0.92和0.69)的效应大小，表明结果具有可重复性。所确定的集群的人口统计信息如表1所示。
图1 脑电图测量识别了四个ALS聚类:融合相似矩阵和ALS聚类的最优数量。
(A)基于聚类对ALS患者的融合相似性矩阵进行分类，并使用谱聚类进行识别。
(B)k=4时，两种测量都反映最佳聚类数达到最高的显著性。
表1 聚类特征分解
脑电图显示了不同的神经生理特征
基于脑电图测量的四个聚类的神经生理特征分析显示，每个聚类的神经网络明显受损(图2)。例如，聚类1在额颞叶网络中表现为β波段频谱功率增加的特征，而聚类3和4在同一网络中表现为功率降低。类似地，聚类2表现出躯体运动网络中α波段同步性增强的特征，聚类3表现出额颞网络中γl波段同步性减弱，聚类4表现出额顶叶网络中γl波段共调制性增强。Kruskal-Wallis单向方差分析表明，这四种网络在不同的集群之间存在显著差异。
与所有四个聚类相关的脑电图异常被确定为初级躯体运动皮质和额颞脑区域的调节增加(δ-α波段振荡)和同步性减少(δ-β波段振荡)(见补充图1)。
图2：对于每一个聚类，使用ALS聚类和控制数据之间的AUC统计估计来确定一个独特的神经生理变化(大脑网络、频带和脑电图测量)。在这四种情况下，集群之间的网络差异很大。在线性模型分析的基础上，拒绝了年龄和性别对所识别的变化的潜在影响。AUC：特征曲线下以零为中心的面积;与健康对照组相比，正值表示增加，而负值表示减少。
图2 肌萎缩性脊髓侧索硬化症群不同的神经生理特征
补充图1：脑电图代表了使用所有ALS患者(第一个面板)和每个分组(面板2-5)分别与健康对照组进行的频谱测量(A:频谱功率，B:调制和C:同步)的统计比较。第一个面板反映了四个组共有的脑电图变化，而其他面板反映的脑电图异常，在不同的集群显著不同。
补充图1 肌萎缩性脊髓侧索硬化症集群的完整神经生理特征
除了临床亚表型外，聚类与总生存率的显著相关。生存概率曲线(图3C)显示，聚类4的生存概率最短(中位数:~3年)，而聚类2的生存概率最长(~6年)。图3：四个脑电图组(颜色编码)表明不同领域的功能/临床评分有不同的趋势：
(A)归一化ALSFRS-R(延髓、肢体和呼吸)和(B)z得分ECAS(语言、流畅性、执行力、记忆和视觉空间)和归一化BBI(行为)得分均不显著。(C)ALS组对应的Kaplan-Meier生存曲线。(D-F)临床特点。
图3 脑电图测量得到的ALS群的临床特征与神经生理特征一致
虽然聚类与常用的临床分层参数(初始诊断类型、发病部位和C9orf72基因状态;图3D-F)不显著，但是结果与群集的临床特征一致。具体来说，聚类3和聚类4(在大多数认知子评分中，这两个组的损害程度最大;图3B)包括所有初始诊断为ALS-FTD的患者。此外，与类别2和3相比，类别4 C9orf72阳性患者的比例最高。
在疾病持续时间、King分期、年龄、性别或使用利鲁唑方面，组间没有显著差异，这可能影响脑电图测量和报告的结果(补充图2)。此外，我们证明King分期不能解释脑电图网络识别的集群，也不能解释脑电图集群中进展模式的差异(补充图3)。在线性模型分析的基础上，测试和拒绝年龄和性别对神经生理特征变化的潜在影响。
补充图2：比较四个确定的聚类(颜色编码)使用(A)功能得分在不同的领域，包括ALSFRS-R(延髓、肢体和呼吸)、ECAS(语言、流畅性、执行力、记忆和视觉空间)和BBI(行为)得分；(B)从发病报告时间到脑电图记录日期测量的疾病持续时间;(C)反映疾病负担的King分期(1-4期，早期-晚期)；(D-F)年龄、性别和利鲁唑用法。
补充图2 ALS聚类的临床概况和可能影响聚类结果的潜在因素
补充图3：(A)四个King亚组(颜色编码)在正常的ALSFRS-R(延髓、肢体和呼吸)中显示有统计学意义差异，但在(B)z评分的ECAS(语言、流畅性、执行力、记忆和视觉空间)和正常的BBI(行为)中没有差异。(C) Kaplan-Meier生存曲线和(D-F)临床特征。
补充图3 肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者按King分期分组并没有不同的生存概率
患者群集在多次测试中显示稳定性
进一步分析表明，各聚类具有较高的准确性和稳健性，重估时保持稳定。具体来说，基于Louvain局部检测方法的聚类解收敛到相同的聚类数(k=4)，并且与主分析的频谱聚类解有很高的重叠，其中只有7例患者被不同分配。此外，估计的聚类精度达到89%，稳健性分析表明，在存在数据扰动的情况下，82%的聚类标签保持稳定。最后，使用纵向数据集，总体聚类分配为72%(图4)，表明发现的聚类具有实验稳定性。图4：总体稳定性为72%，具有统计学意义。随访患者总数N=36。
图4 集群表现高稳定性
仅基于临床数据的聚类不能确定稳定的亚组
采用相同的方法，将所有临床指标进行合并，并对指标进行统计分析，以估计最佳聚类数量。没有发现显著的聚类，这表明普遍应用的临床决定因素并没有驱动神经生理聚类数据(见补充图4)。
补充图4 与脑电图数据相比，基于临床数据的ALS聚类的最优数量和聚类解的稳定性
4. 讨论
我们已经证明，使用多维定量脑电图分析网络干扰可以识别ALS中使用标准临床评估工具无法发现的子组。每一个亚组，通过数据驱动的聚类识别，展示了一个独特的神经生理学轮廓，反过来概括了不同的临床属性组合。这些神经生理特征在重新评估时是稳定的，并与不同的预后结果相关。
已识别的脑电图聚类表征了不同的脑网络损伤
临床异质性已成为理解神经退行性疾病病理生理学的主要障碍。这对药物开发有影响，因为临床分层参数作为疾病进展和生存的预测因素仍然相对不敏感。虽然我们确定的集群的网络中断特征与通常定义的疾病临床表型亚型没有很强的相关性或重叠，这并不令人惊讶，但我们的结果与以前研究的观察结果一致。例如，本研究的聚类4中C9orf72患者比例最高，已知C9orf72可累及额颞、颞顶和皮层下脑组织和EEG改变，并常与认知和行为障碍相关。因此，在我们的研究中，这一聚类的神经生理特征是额顶叶网络(也称为中央执行网络)内的γl-波段共调节的显著异常变化，而这一聚类的临床特征显示了显著的语言流畅性障碍。类似的，这一组群有最多比例的延髓病变患者，MRI研究显示额颞叶，颞顶和皮层下的大脑区域广泛变薄。此外，虽然聚类4有最高比例的C9orf72扩展患者，这与ALS和FTD都相关，但聚类3和4包括所有ALS-FTD患者。与其他研究一致，在我们的分析中，这两种脑电图表型显示最低的生存概率。考虑到这两组患者在认知和行为方面明显增加的功能障碍，这些ALS患者的临床特征可能与ALS-FTD频谱中的FTD侧一致。然而,C9orf72患者没有形成一个单独的聚类。这些发现证实了目前在ALS分类系统中使用的变量(例如基因突变状态和FTD的存在/不存在)的复杂性和异质性。相比之下，由脑电图测量得出的亚型超越了ALS患者的传统分类系统，并在每个亚组中表现出不同的大脑网络特征。
我们的发现与之前对ALS的神经电磁研究一致。例如，最近一项静息状态脑磁图(MEG)连接研究报告称，大脑后部的宽带共调制增加。此外，利用图论研究大脑网络拓扑结构的研究显示，发散的MEG γ-同步(通过相位滞后指数评估)影响全局大脑模式，而增加的EEG γ-同步(通过部分定向相干性评估)影响额叶网络模式。这些静止状态的发现与集群3和集群4中识别的连接模式一致。
聚类1和聚类2的神经生理特征分别指向β带额颞叶和α带运动网络的特征变化，而相应的语言、语言流利性和运动区域的临床评分表明这些功能相对保留。这些异常的网络激活可以归因于拓扑弹性或每个集群特有的主动补偿机制，也可能是目前临床工具不够敏感。我们的工作强调，当ALS患者与对照组作为单一组进行比较时，并非所有的群体特异性模式都可以识别。这是由于不同群体之间的损害模式的差异。确认的β波段功率变化表明两种不同的模式，这可以解释MEG研究报告肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者皮层β去同步化增加和脑电图研究报告差异减少或没有差异之间的矛盾。此外，利用图论研究大脑网络拓扑的静息态研究结果显示，脑电图α同步性(通过部分定向相干性评估)和α波段调制性增加主要发生在大脑中央区域。
临床意义
我们已经证明，基于大脑网络中断模式的集群与临床属性和疾病进展率的可重复聚集相关，证实了我们的研究结果的临床相关性。以脑电图为基础的具有优越统计能力的亚型并不能概括所有的临床数据。这表明，这些神经生理模式提供了额外的信息，这是由临床评估单独识别。以脑电图为基础的聚类在统计学上是稳健的，具有不同的模式，而单独的临床评分不能形成有意义的显著聚类。更深入的分析，进一步探索脑电图和临床观察之间的联系，将需要更大和详细的临床和基因组数据集。
这种具有高统计力的稳定亚型的鉴定具有显著的生物学和临床意义。我们的发现可能有助于修改现有的分层系统，这是纯粹基于临床观察。事实上，模拟分析对新患者产生了较高的分类准确率(89%)，即将个体患者分类为聚类，这表明我们的聚类方法有潜力在个体患者水平上提供有临床意义的发现。虽然决定这些模式或网络破坏的潜在神经生物学过程在这一点上不能被识别，集群的稳定性可以反映出网络功能和完整性的病态前模式。
5. 局限性
本研究的局限性在于其单一位点的性质。可能存在超过四个聚类的替代解决方案，特别是如果在聚类分析中包括更多复杂的神经生理测量。尽管有这些局限性，我们对聚类解决方案的保守验证分析表明，这些结果是稳定的和可重复的。
将我们的研究结果转化为临床需要具有相同或更少EEG电极数量的医疗级设备(例如，来自10-20系统的32或19个)，这需要进行额外的验证研究。虽然这可能减少准备时间，但应谨慎处理研究表明，少于32个传感器的电极阵列会导致严重的定位错误。此外，我们的神经生理概况包括γ波段的发现，在这种情况下，减少电极的数量可能对我们捕捉这些振荡的能力有负面影响。然而，由于定位精度从64个通道开始趋于稳定，医疗级别的64个通道的系统可以被视为未来的候选系统。
