随着单细胞数据文章发表得越来越多，单纯的依靠单细胞挖掘，虽有亮点，但是难度貌似越来越大。但是我们就止步了嘛？咱们就一个字：漏！正所谓蹭热度、强强联合，单细胞结合当今研究热点“自噬”，或许可以给我们带来新的思路。在pubmed上搜索相关关键词，目前只有2篇文章发表，毕竟是换一个癌种就可能发表，老铁们还在等什么咩？
今天给大家介绍一篇2022年2月刚刚发表在Frontiers in Cell and Developmental Biology上的文章，本研究通过整合单细胞RNA测序数据和批量RNA测序建立自噬相关风险模型用于胃癌预后。
摘要
自噬与肿瘤进展、预后和治疗反应有关。然而，自噬相关模型及其临床意义尚未完全阐明。在本研究中，通过批量 RNA 测序和单细胞 RNA 测序的综合分析，确定了自噬相关的风险模型。该模型能够区分胃癌 (GC) 患者的较差预后，这在 TCGA 和两个独立的基因表达综合队列中使用生存分析进行了验证，并且还独立于通过多变量 Cox 回归评估的其他临床协变量。使用ROC和列线图分析进一步评估该模型的临床价值。对单细胞 RNA 测序的研究发现，该模型可能作为高危人群中 T 细胞功能障碍特征的指标。此外，高风险组的免疫检查点标记物（PDCD1和CTLA4）表达较低，这表明对GC患者当前免疫治疗反应的潜在预测能力。总之，这种自噬相关风险模型可能是预后评估的有用工具，并将促进该模型作为预测性免疫检查点生物标志物指标的潜在应用。
方法
1.数据集获取：从GEO数据库获取GSE62254、GSE15459、GSE134520、GSE146027和GSE91061的表达矩阵。利用Zhang等人（2019）单细胞RNA测序数据集，其中包括非营养性胃炎（NAG）、慢性萎缩性胃炎（CAG）、肠化生（IM）和早期胃癌（EGC）。从TCGA数据库下载255例胃癌样本数据。
2.自噬相关基因表达数据的鉴定和评估:自噬相关表达数据在人类自噬数据库（HADb）和 GSEA 数据库中获取567个自噬相关基因。使用LASSO-Cox回归模型和随机森林回归分析，筛选与预后有关的自噬相关基因。根据每个预后基因的表达水平计算每个患者的风险评分。
3.单细胞RNA测序数据的分析：采用PCA和t-SNE方法进行降维。根据标记基因对聚类进行注释。通过从分子签名数据库（MsigDB）下载的通路基因集的平均表达来评估通路活性得分。
4.构建列线图：绘制列线图，此后的校准图用于评估列线图的预测准确性。
5.统计分析：多变量 Cox 回归用于测试风险评分是否独立于其他已知风险因素。采用受试者工作特征（ROC）分析，根据风险评分、AJCC分期和组合模型评估生存预测的敏感性和特异性。
结果
1.单细胞分辨率下，自噬与胃癌进展密切相关。
通过 NAG-CAG-IM-EGC 序列检测到“伴侣介导的自噬”的通路评分随着 GC 的进展逐渐增强(图1B)，而“自噬负调控”的通路评分持续下降(图1B)。表明自噬的激活可能与单细胞分辨率下 GC 的进展有关键联系。
图 1.自噬与单细胞分辨率下胃癌的进展密切相关
2.胃癌预后自噬相关风险模型的建立和验证
LASSO Cox 回归模型和随机森林回归模型用于构建预后特征。在生存分析中，在 TCGA 中计算每个患者的自噬相关特征风险评分，根据中位风险评分将患者分为低风险组和高风险组。高风险组患者的预后明显低于低风险组患者。（图2A）。紧接着为了研究自噬相关风险评分的预后价值是否独立于与 GC 进展相关的其他临床因素，使用风险评分、年龄、性别、肿瘤分期和淋巴结数量进行多变量 Cox 回归分析作为协变量。证明自噬相关风险评分作为一个连续变量与较差的预后显着相关（p < 0.001）（图2B）。上述结果均在两个独立的数据集（GSE62254 和 GSE15459）中得到进一步验证（图2C/E、图2D/F）。研究结果表明，自噬相关风险评分模型在预测胃癌预后方面显示出无偏效果。
图2.预测胃癌预后的自噬相关风险评分的建立和验证
3.自噬相关风险模型在胃癌中的临床价值
作者试验ROC分析表明与 AJCC 癌症分期系统和淋巴结数量相比，自噬相关风险模型具有最强的预测能力（图3A）。整合了自噬相关风险评分和 AJCC 分期，列线图可以评估GC 患者 3 年、 5 年 DFS （图 3B），（图3C）为预测DFS的校准图。DCA用于评估列线图的临床效用（图3D）。结果表明自噬相关风险模型在 GC 患者的临床管理中具有可靠的预测能力。
图 3.自噬相关风险评分模型在胃癌中的临床价值
4.自噬相关风险模型预测不同风险组间T细胞特征的变化
作者首先利用Zhang 等人的单细胞数据集，得出低危组肿瘤微环境（TME）浸润的免疫细胞比例更高（图4A）、参与免疫反应的 T 细胞激活只发生在低风险组（图4B）。然而作者发现与免疫效应功能相关的途径如“参与免疫反应的 T 细胞活化”、“活化的 T 细胞增殖”和“T 细胞介导的免疫”在低风险组中富集，而在Zhang等人的研究中，高危组的单细胞数据集中，它们有所减少（图4C）。此外，与抗肿瘤免疫负调节相关的途径，例如“T细胞介导的细胞毒性的负调节”和“T细胞介导的免疫的负调节”，在高危组中富集（图4C)。
根据自噬相关风险模型将 TCGA 患者分为低风险组和高风险组，发现高危组中的T 滤泡辅助细胞 (Tfh)、激活记忆 CD4 T 细胞和 2 型 T 辅助细胞 (Th2) 显着减少，而与癌症进展有关的调节性 T 细胞 (Tregs) 的比例在高危组中显着升高（图4D-G）。
此外，进一步将单细胞数据集中的 T 细胞重新聚集到 CD8 T 细胞和 CD4 T 细胞中研究发现，在高危组中：CD8 T 细胞介导的细胞毒性相关的基因(CD8A、GZMA和GZMB)显著降低（图4H)。小提琴图显示高危组中：CD8 T 细胞中“T 细胞活化”以及CD4 T细胞中“T细胞抗原和呈递”的活性评分分布降低（图4I、J），这表明高危组预后不良与 T 细胞功能失调有关。
进一步调查了高危患者的不良预后是否是与免疫治疗无效反应有关，发现PDCD1和CTLA4在低风险组显着增加，而在高风险组减少（图4K）。为了验证自噬相关风险评分在预测免疫治疗反应方面的功效，作者使用了两个公共数据集进行评估。与未治疗组相比，在抗 CTLA-4 mAb 治疗的 GC 小鼠模型中，自噬相关风险评分在第 3 周显着降低。（图4L）。此外，在接受检查点阻断治疗的患者队列中，我们发现与CR/PR的患者相比，患有SD/PD的患者的自噬相关风险评分显著升高（图4M）。低风险组患者的免疫治疗反应效果（33.3%）高于高风险组患者（8.0%）（图4N）。
图4.自噬相关风险模型预测不同风险组间T细胞特征的变化
小结
在该研究中，作者联合批量 RNA 测序数据集和单细胞 RNA 测序数据集进行分析，构建自噬相关预后模型可以预测GC患者的生存情况，以及作为 GC 患者免疫治疗反应预测生物标志物的补充。小伙伴们可以根据这个思路动动手模仿起来哦
