文章来源：
Ortiz-Ramírez C, Guillotin B, Xu X, Rahni R, Zhang S, Yan Z, Coqueiro Dias Araujo P, Demesa-Arevalo E, Lee L, Van Eck J, Gingeras TR, Jackson D, Gallagher KL, Birnbaum KD. Ground tissue circuitry regulates organ complexity in maize and Setaria. Science. 2021 Dec 3;374(6572):1247-1252. doi: 10.1126/science.abj2327. Epub 2021 Dec 2.
图片.png摘要
大多数植物根部具有复杂的皮层结构，来构成器官的主体，并在生理学中发挥关键作用，例如耐洪和共生作用。然而，除了对拟南芥高度简化的解剖结构外，对皮层的形成知之甚少。因此，纽约大学的研究人员使用scRNA技术构建了玉米根的单细胞分辨率图谱，揭示了与扩张皮层相邻的组织形成转录因子 SHORT-ROOT (SHR) 的研究机制。研究人员发现玉米 SHR 蛋白是超移动的，可以至少移动八个细胞层到皮质中。玉米与玉米的同源物种狗尾草中的高阶 SHR 突变体皮质层的数量均减少，表明 SHR 通路控制皮质组织的扩张以阐述解剖复杂性。
研究背景
根是一个径向对称的器官，主要由三个基本组织的类型：外围的表皮毛、中部的基本组织及中柱中心内的维管束和中柱鞘。基本组织进一步分为内皮层和皮层两种不同的细胞类型，基本组织在中柱周围排列形成同心圆。基本组织中不同的皮层细胞的数量是根部形态的多样性的决定性因素之一，使得植物具有可以适应多种胁迫的能力。
https://www.dreamstime.com/diagram-showing-internal-root-structure-diagram-showing-internal-root-structure-illustration-image167952061.png而模式物种拟南芥中基本组织的组成组分内皮层和是皮层，控制两者主要的信号通路基本与SHR-SCR有关。SHR突变体是1993年通过EMS处理，筛选M2代突变体和8000个T-DNA插入系，获得一个根系明显短于野生型的株系，命名为shr突变体(Philip N et al, 1993)；SCR突变体是通过观察根组织径向组织的大小，进行了遗传筛选，发现shr、scr、pic、glm、wol及fs突变体的根生长缓慢(Ben Scheres, 1995)。
Philip N et al, 1993(Short-root plant (right) and wild-type plant (left) at approximately 7 days after germination.).png
Ben Scheres, 1995.png其中，Benfey实验室为定位SHR蛋白，选用SHR::GFP转基因根毛对基因进行定位，发现不仅在中柱部位发现荧光，在中柱细胞周围的相邻层（静止中心 (QC)、皮质/内皮层的母细胞和子细胞，以及内皮层的所有细胞）都可以发现荧光，原位杂交及启动子报告SHR基因均检测到了基因的表达，因此得出SHR基因在中柱高表达且仅移动到相邻层细胞中。
Nakajima et al, 2001.png同时为探究SHR 蛋白在特定细胞类型及介导根部细胞分裂中的作用，研究人员通过内皮层特异的启动子SCR来驱动SHR蛋白的表达，构建了SCRpro::SHR株系，发现通过CaMV35S 启动子异位 SHR 表达的line表型相反，SCRpro::SHR株系的基本组织均呈现高度的径向对称性。
Nakajima et al, 2001.png随后Benfey实验室在2007年选用pull-down及酵母双杂实验对SCR及SHR蛋白是否互作进行验证，发现两者均可互作。
Cui HC et al, 2007.png基于以上猜想，研究人员在进化的角度上探究在水稻中SHR-SCR的调控机制。首先blast出水稻出4个高度同源的基因，选用原位杂交对这几个基因的表达位置进行探究，发现与拟南芥的表达位置高度相似；又选用酵母双杂进行了验证，发现两个蛋白之间也存在互作。以上结果表明在进化上，SCR-SHR的互作模型在高等植物调控radial patterning是一个保守的机制（Cui HC et al, 2007）。
Cui HC et al, 2007.png科学问题
因此，根生物学中的一个经常讨论的问题是不同的组织模式如何调整以产生不同的根形态，同时有哪些信号通路控
制着不同物种之间的发育差异。
然而，SHR 在扩大单子叶玉米皮层数中的作用尚不清楚。
用于快速组织标记的染料渗透性方法
玉米根是一个比较适应于研究根部解剖结构的一个组织，因为玉米根的根分生组织内可以衍生出多层皮层组织（8 到 9 个皮层细胞层），并且易于制备原生质体，比较符合植物的scRNA-seq研究。然而如何识别相对正确的细胞类型是其中的一个挑战，主要原因是不同物种的组织之间存在异质性，由于不断的进化，即使是同源性较高的物种，相同的基因也不一定具有较高的保守性。
因此研究人员为了对这个问题进行矫正，根据根部组织的同心排列，开发一种通过染料外显率标记 (DPL) 对细胞层进行荧光标记的技术。主要是一种高渗透染料(Syto 40蓝)在中柱上着色较低，但可检测到染色整个根，而弱渗透染料(Syto 81绿)在外层组织中染色强烈，内部组织中信号强度逐渐下降，便于用流式分选获取相应的细胞类型；同时通过ZmSCR1:: RFP 驱动的荧光蛋白产生的荧光散点图对两个染料的结果进行矫正，来定向组织的径向位置。
DPL染色及矫正.png随后选用ZmWOX5::RFP荧光流式分选获得QC细胞，因此通过流式分选获得QC细胞、表皮细胞、皮层细胞、内皮细胞、中柱细胞及根冠细胞六种细胞类型。随后还选用已发表的机械分离的数据集与本研究的结果进行比较，发现具有较高的一致性（>80%）。
图片.png玉米根的单细胞图谱
研究人员选用7日龄的B73玉米幼苗的根尖，选用酶解法制备原生质体。随后，利用这些细胞在10X genomic平台制备单细胞cDNA文库。三个重复共获得了14755个高质量的细胞。选用UMAP降维，将这1万多个细胞划分成了20个亚群。为对分群的结果进行统计，选用ICI算法（细胞身份指数）进行量化，确定分离的细胞类型与FACS的结果符合。
通过对细胞的亚群进行进一步的分析，发现中柱和皮层中存在多个细胞类型的亚群，表明中柱和皮层中存在细胞特特异化。有可能是因为根尖在向根冠分化发育的阶段中发育出了不同的细胞类型，这些不同的亚群对应不同的细胞类型。为了区分由不同状态而非分化形成的亚群，研究人员进一步通过解剖根结构生成了一组细胞成熟标记转录本，分别包含分生区、过渡区和伸长区，共16个不同发育状态，并对样本进行RNA-seq分析。通过分析确定了三个主要的表达状态：早期分生组织（在分生组织中高表达，并向过渡区逐渐减少）、过渡区（特定于中期成熟点）和过渡后（在分生组织中低表达，并向延伸区逐渐增加）。随后生成一个细胞分化评分来标记每个细胞的成熟状态，在单细胞图谱中中解析不同亚群的细胞发育轨迹。
玉米根单细胞图谱.png高通量图谱解析玉米皮层细胞的复杂性
在进行FACS分选时，主要获得了6个主要细胞亚型，但是在进行UMAP降维分析时，获得了20个细胞亚群，因此表明在少数情况下，细胞成熟状态确实是影响细胞分组为亚群的主要因素，这些大多数亚群由具有广泛分化状态的细胞组成，表明在大多数情况下，该分组代表不同的细胞身份。尽管两个皮层亚群似乎是成熟皮层细胞的前体状态（簇8和簇14），但通过证实至少存在四种不同的皮层亚群（簇1、簇2、簇13和簇19）。 随后也通过各亚群之间的差异基因进行分析，也确定了相关的结果，表明皮层细胞确实是至少存在4种不同的细胞类型。
因此有一个问题是什么样的信号机制使得玉米皮层细胞出现了亚群分化。随后scRNA-seq数据显示，核心模式基因SHR的表达只针对内皮层，而不在中柱细胞表达。在DPL和单细胞分析中，SHR的所有三个玉米同源基因（ZMSH1、ZMSH2和ZMSH2-h）都在内皮层富集。因此推测这种靠近皮层的可移动、分裂诱导转录因子的表达可能与该组织的扩张有关。
图片.pngSHR移动因子在调节玉米和狗尾草皮层复杂性研究
既然SHR移动因子与皮层扩张有关，因此研究人员选用原位杂交实验来对玉米的shr的同源基因的表达位置进行定位，发现均定位在皮层上，同时ZMSH2的1.4kb上游和下游转录报告子也在根内皮层中显示信号，这与研究人员染色和单细胞图谱一致。
以前有研究人员在水稻中得到shr在内皮层到相邻的皮层是可以移动的，因此研究人员也想探究在玉米中这个模型是否保守。研究人员构建了一个融合黄色荧光蛋白（ZMSH1:：SHR1-YFP）的ZMSH1报告系统。发现玉米SHR1蛋白报告基因存在于皮层。同时发现玉米SHR1蛋白至少在八个皮层层中移动。此外，当在拟南芥的内胚层中表达时，ZMSH1蛋白似乎也具有超移动性。其余的SHR基因是否可以超移动也是一个待解决的问题。
在拟南芥中SHR基因与SCR基因互作，为了探究玉米中是否如此，通过构建玉米SCR报告系，以确定与SHR的共定位。发现通过原位杂交及共定位结果发现均在根的内皮层有较强的信号，与拟南芥的定位结果类似。然而，ZmSCR-GFP蛋白在中柱中显示出一个信号，表明玉米中的SCR蛋白在细胞间以与SHR相反的方向移动 。研究结果表明SHR及SCR在内皮层中共存，同时选用玉米的同源物种狗尾草进行验证，也得到了相同的结果。
基因定位情况.png因此有种模型猜想是将 SHR 与皮层细胞层数目扩张有关，增加蛋白质的向外运动可能会触发周围细胞分裂，从而产生多余的细胞层。为对这种猜想进行验证，研究人员对三个不同的玉米 SHR 同源基因使用 CRISPR-Cas9 构建功能丧失突变体。并对两个基因（ZmSHR2 和 ZmSHR2-h）的突变体进行回补，发现单突与野生型相比没有明显的皮层细胞变化，然而，Zmshr2/2-h双突变体的皮层细胞数显著减少，与野生型的8或9层相比，大多数有7层。同时当拟南芥中缺失shr基因后，内皮层结构消失，然而玉米突变体中没有出现内皮层减少的现象，因此推测在玉米中SHR基因对于皮层层数增加有重要作用。
随后研究人员准备探究其余单子叶植物是否也这样，因此也选用了狗尾草进行突变体构建。共获得两个突变体，其中一个与野生型相比，没有明显的表型变化，但是另一个与野生型相比，根皮层数量明显减少（野生型：4~5层；突变体：1~2层）。更加证实了shr基因在单子叶植物皮层细胞层数扩张的重要性。
但是由于 SHR 介导的皮层外细胞分裂可以通过介导干细胞生态位附近内皮细胞的连续分裂与 SCR 直接相互作用而发挥作用。还是，SHR 过度活动可能导致皮层细胞直接分裂，与低水平的 SCR 或其他蛋白质相互作用。目前，还无法区分这两种模式。
图片.png研究意义
上述研究结果表明SHR在单子叶植物中具有控制皮层扩张的作用，这为环境适应提供了较多的理论基础。也阐述了一个保守的发育调节因子的细微差异如何能够介导产生特殊功能的复杂性。研究人员在生物信息学分析中确定了四种不同的皮质细胞亚型，尽管需要进一步的工作来验证它们的空间关系。最后，结果表明，使用单细胞解析的快速转录组图谱可以提供对介导解剖多样性的机制进行解析。使用染料标记生成的细胞标记图谱及 scRNA-seq技术提供的玉米根组织图，可为玉米和相关植物提供参考。
参考文献
Philip N. Benfey, Paul J. Linstead, Keith Roberts , John W. Schiefelbein , Marie-Theres Hauser and Roger A. Aeschbacher. Root development in Arabidopsis: four mutants with dramatically altered root morphogenesis. Development 119, 57-70, 1993.
Hongchang Cui, Mitchell P. Levesque, Teva Vernoux, Jee W. Jung, Alice J. Paquette,
Kimberly L. Gallagher, Jean Y. Wang, Ikram Blilou, Ben Scheres, Philip N. Benfey. An Evolutionarily Conserved Mechanism Delimiting SHR Movement Defines a Single Layer of Endodermis in Plants. SCIENCE. 316,20 APRIL 2007.
Ben Scheres, Laura Di Laurenzio, Viola Willemsen , Marie-Therès Hauser, Kees Janmaat,
Peter Weisbeek, Philip N. Benfey. Mutations affecting the radial organisation of the Arabidopsisroot display specific defects throughout the embryonic axis. Development 121, 53-62, 1995.
Nakajima K, Sena G, Nawy T, Benfey PN. Intercellular movement of the putative transcription factor SHR in root patterning. Nature. 2001 Sep 20;413(6853):307-11.
