前言
题目：Application of Single-Cell Multi-Omics in Dissecting Cancer Cell Plasticity and Tumor Heterogeneity 日期：2021-10-15 期刊：Front. Mol. Biosci 链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmolb.2021.757024/full
介绍
肿瘤异质性，包括遗传异质性、表观遗传异质性、表型和功能异质性，在肿瘤进展中起着至关重要的作用。研究肿瘤异质性的起源一直是研究的重点。例如，已经提出癌症干细胞、克隆进化和细胞可塑性的理论来解释异质性的起源。此前，高通量测序技术已被用于在癌症研究领域进行分子亚型分类、监测治疗反应、确定新的治疗靶点和探索肿瘤异质性。
但是，这些技术并不是研究肿瘤内异质性的理想工具，因为它们通常检测混合细胞群的平均信号，而不是组织内单个细胞的信号。此外，批量测序技术很难确定肿瘤生态系统中不同细胞亚群的突变状态或转录组。相比之下，单细胞技术在剖析细胞组成及其分子特征方面显示出巨大优势，为揭示单个细胞的混合状态提供了机会。例如，通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 在人类癌症中发现了多种癌细胞的混合状态，例如混合 EMT 细胞和癌症/免疫细胞。此外，单细胞技术在识别稀有细胞群方面具有强大的能力。最后，单细胞技术可以区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞成分，还可以推断这些细胞成分内部或之间的相互作用。因此，与批量测序技术相比，单细胞技术提供了更精细的肿瘤组织分子特征。
癌细胞可塑性是指一些癌细胞在不同细胞状态之间动态迁移，从而导致肿瘤异质性增加并促进肿瘤进展。然而，调节细胞可塑性的分子机制仍然难以捉摸。在这篇综述总结了通过单细胞多组学技术剖析癌细胞可塑性和肿瘤异质性的最新进展，包括 scRNA-seq、单细胞 DNA 测序 (scDNA-seq)、单细胞蛋白质组学和单细胞多组学技术。
解析肿瘤异质性
肿瘤异质性的单细胞RNA测序分析
scRNA-seq 已被广泛用于探索肿瘤内异质性。例如，scRNA-seq 揭示了胰腺导管腺癌 (PDAC) 中的七个癌细胞亚群。然而，大多数 PDAC 患者仅共享一个亚群，而其他六个亚群存在于 1-2 名患者中（Peng et al，2019 年）。
此外，已发现来自不同 PDAC 患者的肿瘤细胞很难聚集在一起，这表明 PDAC 的肿瘤间异质性很高（Lin et al., 2020）。scRNA-seq 也被用于识别罕见的癌细胞亚群，以前很难被bulk RNA-seq 识别。例如，通过 scRNA-seq 在原发性胃腺癌中鉴定出五个癌细胞亚群，其中三个对应于 Lauren 亚型的组织病理学特征，而另外两个被认为是具有不同分子特征的新亚群（Zhang M. et al., 2021）。
另外，scRNA-seq 探索了不同癌细胞亚群的功能异质性。例如，scRNA-seq 确定了肺腺癌 (LUAD) 的三种不同转录状态，即 tS1、tS2 和 tS3 ( Peng et al., 2019）。tS1和tS3的转录状态与正常肺上皮细胞相似，提示正常肺上皮细胞可能是LUAD的来源。然而，tS2 显示出完全不同的转录特征，其特征是与晚期肿瘤相关的基因表达增加（Tirosh et al，2016 年）。
肿瘤异质性的单细胞DNA测序分析
scDNA-seq 已被用于识别单核苷酸变异 (SNV)、拷贝数改变 (CNA) 和结构变异 (SV)，以及研究肿瘤的遗传异质性。例如，使用 scDNA-seq 研究胃食管结合部癌的 CNA 模式，发现在原发肿瘤和转移淋巴结中都有两个以上具有不同 CNA 模式的亚克隆，表明在原发肿瘤和转移淋巴结中都存在广泛的肿瘤内异质性（Duan et al，2021 年）。
此外，scDNA-seq 已被用于检查液体活检中循环肿瘤细胞 (CTC) 的异质性，并以非侵入性方式监测癌症基因组。例如，scDNA-seq 在炎症性乳腺癌患者的活检和 CTC 中检测到相同的 TP53、RB1、PIK3CA 和 ERBB2 基因突变，这表明 CTC 可能反映原发性肿瘤的遗传畸变并作为肿瘤异质性的替代检测资源（Bingham et al，2017 年）。
肿瘤异质性的单细胞蛋白质组学分析
单细胞蛋白质组学技术也可以用来研究肿瘤异质性并揭示肿瘤进展的机制。例如，Wagner 利用CyTOF分析了 144 个人类乳腺肿瘤和 50 个非肿瘤组织。他们将上皮细胞分为七个腔亚组（L1-L7）和两个基底亚组（B1 和 B2）。值得注意的是，观察到 L3 管腔亚组表达高水平的 EpCAM 和 CD49f 但ERα表达量低，这是管腔祖细胞的特征。相比之下，L4 管腔亚组显示出高水平的 ERα、AR、HER2、EGFR 和 c-MET，它们与肿瘤细胞增殖和迁移有关。他们还发现通过免疫组织化学染色识别为 ER 的肿瘤也包含一部分 ER -细胞群（Wagner et al，2019）。
此外，Schulz 使用基于 RNAscope 的原位杂交方案与 CyTOF 相结合分析了乳腺癌中的亚细胞分辨率 mRNA 和蛋白质（Schulz et al，2018 年）。CyTOF 和免疫组织化学染色的结合使我们能够可视化不同细胞成分的空间分布（Giesen et al，2014 年）。
除了 CyTOF，多种免疫荧光成像技术已被用于检测单细胞中的多种蛋白质。例如，循环免疫荧光 (CycIF) 已用于检查福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 标本（Lin et al., 2018）。
肿瘤异质性的单细胞表观基因组学分析
单细胞表观基因组学技术用来研究异质组织内细胞成分的表观遗传特征，例如单细胞 DNA 甲基化测序和单细胞染色质图谱。例如，单细胞 DNA 甲基化测序显示，来自不同结直肠癌患者的肿瘤来源的克隆类器官表现出不同的表观遗传状态，一个肿瘤包含多种表观遗传状态（Roerink et al，2018 年）。单细胞 ChIP-seq 用于研究乳腺癌染色质状态的异质性，结果表明耐药肿瘤比敏感肿瘤表现出更多的异质性。值得注意的是，在敏感肿瘤中也可以检测到一小部分具有耐药特征的肿瘤细胞，表明预先存在耐药亚群（Grosselin et al., 2019）。
Wang et al在2019年使用 scATAC-seq 确定了胶质母细胞瘤中的三种癌细胞亚群，包括前神经细胞、间充质细胞和中间细胞状态。此外，scATAC-seq 帮助研究了肺腺癌小鼠模型中癌细胞的动态进化，揭示了癌症进展的表观遗传连续性（LaFave et al，2020）。
解剖基质细胞的异质性
肿瘤微环境 (TME) 在癌症的发展和进展中起着至关重要的作用，它由多种细胞成分和细胞外基质组成。
泛癌的单细胞分析揭示了基质细胞的广泛异质性，包括癌症相关成纤维细胞 (CAF)、浸润的免疫细胞和内皮细胞 ( Qian et al., 2020）。scRNA-seq 在人类肝内胆管癌中鉴定出六个 CAF 亚群，它们可以通过与肿瘤细胞相互作用促进肿瘤进展（Zhang et al，2020 年）。
此外，已经在跨物种的胶质母细胞瘤中研究了骨髓细胞的单细胞分析，这表明存在两个不同的肿瘤相关巨噬细胞群，小胶质细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞，它们存在于 TME 中并相互竞争生存空间（Pombo Antunes et al，2021 年）。scRNA-seq 也已被用于阐明免疫细胞在乳腺癌抗 PD1 治疗反应中的异质性，这表明 PD1 T 细胞在抗 PD1 治疗后发生克隆扩增（Bassez et al，2021 年）。
追踪癌细胞进化
癌细胞进化是肿瘤进展过程中的一个基本过程。Schlesinger et al使用 scRNA-seq 和轨迹分析发现腺泡细胞和早期化生细胞表现出对两种命运之一的持续变化，这表明化生细胞可能不参与从腺泡细胞、早期化生细胞到肿瘤细胞的进化过程（Schlesinger et al , 2020 年）。
为了追踪癌细胞从原发性肿瘤到转移性肿瘤的克隆进化，Davis et al通过 scRNA-seq 检查了原发性肿瘤和三阴性乳腺癌早期转移的异质性。他们发现转移性肿瘤的异质性与原发性肿瘤一致，但转移性肿瘤中一个亚群的比例明显增加，表明该亚群在转移过程中富集（Davis et al., 2020）。
此外，scDNA-seq已用于研究胃食管结合部癌的基因组异质性和克隆进化，淋巴结转移与原发肿瘤的相似性大于不同淋巴结转移之间的相似性，表明不同的淋巴结转移可以起源于来自同一原发肿瘤但独立进化（Duan et al，2021 年）。
药物治疗已被证明可推动癌症进化并增加肿瘤内异质性。例如，scRNA-seq 揭示了多发性骨髓瘤患者肿瘤克隆进化的三个主要轨迹，表明近一半的患者表现出克隆动力学和转录水平的变化。值得注意的是，一名患者在 4 个治疗周期后表现出从开始治疗时 CSAG1 和 MS4A1 基因高表达的克隆 1 转变为 CSAG1 和 MS4A1 表达下调的克隆 2（Cohen et al，2021）。
单细胞技术揭示混合肿瘤细胞状态
混合上皮/间充质细胞
单细胞测序已在各种癌症中鉴定出肿瘤细胞的多种杂交状态，例如杂交上皮/间充质细胞、杂交肿瘤/免疫细胞和杂交肿瘤/内皮细胞。这些混合状态可以赋予肿瘤细胞以不同的潜力来适应不断变化的微环境。
最近，通过单细胞测序已在多种癌症中鉴定出具有 EMT 特征的癌细胞亚群。例如，胶质母细胞瘤细胞已通过 scRNA-seq 分为四种亚型，包括神经祖样细胞（NPC-like）、少突胶质祖样细胞（OPC-like）、星形胶质样细胞（AC-like）和间充质样细胞( MES-like）细胞。重要的是，揭示了从 OPC 样或 NPC 样细胞到 MES 样细胞的动态转变，表明胶质母细胞瘤细胞具有高度可塑性（Neftel et al，2019）。
此外，Wouters et al报道了黑色素细胞和间充质细胞的中间状态，它由一组转录因子调节，包括 SOX6、NFATC2、EGR3、ELF1 和 ETV4。他们还证明，敲除 SOX10 基因足以将黑素细胞和中间细胞状态转换为间充质样细胞状态（Wouters et al，2020 年）。
杂交肿瘤/免疫细胞
免疫检查点阻滞剂 (ICB) 已在临床上用于治疗癌症患者。然而，只有少数患者对这些 ICB 有反应。不幸的是，关于肿瘤细胞免疫逃避的潜在机制在很大程度上是未知的。
Miao et al发现鳞状细胞癌中的一部分肿瘤起始干细胞选择性表达CD80，这是一种先前确定的免疫细胞表面配体。他们进一步证明，CD80 是肿瘤起始干细胞承受免疫攻击所必需的，CD80 可以通过直接与 CTLA4 结合来抑制细胞毒性 T 细胞的活性（Miao et al, 2019）。Chen et al发现腔内前列腺癌细胞表达 T 细胞共刺激基因，表明肿瘤细胞参与抗原呈递的潜在作用（Chen et al，2021）。这些发现表明表达免疫细胞标志物的肿瘤细胞是肿瘤细胞逃避免疫监视的机制之一，为开发免疫检查点抑制剂和联合靶向治疗提供了新途径。
混合肿瘤/内皮细胞
血管生成是癌症的标志之一。肿瘤细胞可以转分化为内皮细胞并形成血管类似物，为快速生长的肿瘤提供营养。
Williamson 等人发现，来自 SCLC 患者的罕见 CTC 亚群共表达血管内皮钙粘蛋白 (VE-cadherin) 和细胞角蛋白，这与血管生成模拟过程一致，在此过程中肿瘤细胞形成内皮细胞样的血管。他们还发现 VE-cadherin 的敲低可以增加 SCLC 细胞对化疗的敏感性（Williamson et al., 2016）。Carlson 等观察到一种罕见的肿瘤衍生内皮细胞亚群，它有助于神经胶质瘤小鼠模型中肿瘤组织内的血管生成（Carlson et al，2021 年）。这些发现表明具有内皮细胞特征的肿瘤细胞可能在肿瘤生长、耐药性和转移中起重要作用。
单细胞技术的局限性
尽管单细胞技术极大地增强了我们对肿瘤异质性的认识，但这些技术仍然存在灵敏度、规模和准确性有限等多重局限性，需要通过技术改进或与其他技术相结合来解决。
此外，大多数单细胞技术对解离的细胞进行分析，这无法还原肿瘤组织的空间结构。随着新技术的进步，例如空间转录组学（ST），这个问题可以部分解决。但是，目前的 ST 平台分辨率仍然很低，捕获点通常包含几个细胞。
目前，多数 scRNA-seq 方法仅通过捕获 polyA RNA 来检测蛋白质编码基因，这排除了所有非编码基因。
最后，解释单细胞组学技术产生的数据一直是一个挑战，这在很大程度上依赖于生物信息学方法。然而，每种生物信息学算法都有其自身的优势和局限性。例如，在肿瘤内识别出的细胞类型的数量可能会受到使用不同参数的影响。
