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文章题目：Single-Cell RNA-Seq of T Cells in B-ALL Patients Reveals an Exhausted Subset with Remarkable Heterogeneity 期刊：Advanced Science(IF:16.806) 日期：2021-08-08 DOI: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202101447
摘要
背景：功能性T细胞亚群特征是制定免疫治疗策略和预测白血病临床反应的关键。
方法：从健康个体和急性B淋巴细胞白血病 (B-ALL) 患者的外周血中分选出 T 细胞，进行单细胞转录组测序。根据基因表达，无监督聚类将细胞分为13 个 T 细胞亚群。在 B-ALL 患者中发现了健康个体的所有 11 个主要 T 细胞亚群，B-ALL中T细胞显示出更多的免疫通路活化特征。B-ALL中有2个耗竭性T细胞群，其特征是 TIGIT、PDCD1、HLADRA、LAG3 和 CTLA4高表达。值得注意的是，这些耗竭性T细胞群具有显著的异质性，将其并进一步分为 10 个亚群，具有不同的细胞周期阶段、navie状态和 GNLY（编码颗粒溶素）表达模式特征。结合TCR分析，揭示B-ALL 中耗竭性 T 细胞的不同来源，克隆扩增的耗竭性T细胞可能来自CD8 效应记忆/终端效应细胞（CD8 effector memory/terminal effector cells）。
实验设计及质控
样本：3个B-ALL患者和2名健康对照样本的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells ,PBMCs)
细胞前处理：流式分选，其中使用到的流式抗体包括CD45，CD3，CD4和CD8。
细胞过滤标准：more than 800 genes and 2000 UMIs and less than 15% of reads mapped to mitochondrial genes were retained.因为作者主要关注免疫细胞，接着 用CD3D, CD3E, CD3G, CD247 genes 这4个基因的平均表达量作为CD3的平均表达量，如果CD3平均表达值>0.5,则纳入下游分析。此外只保留在至少10个细胞以上有表达值的细胞。最后，总共剩下28842(健康对照样本约12 699个细胞，B-ALL患者有16143个细胞）进入下游分析。
流程图
结果
1.在 B-ALL 患者中特别发现了两群耗竭性T细胞亚群
首先，无监督聚类分析发现，健康个体的T细胞可以分为11 群，而B-ALL患者的T细胞可以分为13 群（Fig 1B）。
接着展示了不同T细胞群典型的marker气泡图（图 1C）。可以看到，占比较大比例的T细胞群是CD4 naive跟CD8 naive亚群（图 1D），而且在B-ALL中出现了2个耗竭性 T 细胞亚群（CD4_Exhau 和 CD8_Exhau），其特征在于高表达免疫耗竭标志物 LAG3、PDCD1、TIGIT 和 HAVCR2。
Fig1 C and D
Pearson 相关性分析显示，B-ALL中，naive、effector和exhaustion T 细胞亚群各自聚集在一起，这与它们是 否是CD4 或 CD8 亚型无关。Treg 和 Th 细胞之间共享了一些相似的基因（LTB、ITGB1 和 PLP2）。CD4_Naive、CD8_Naive 和 CD8_CM 细胞位置接近，因为它们都表达了naive marker(例如TCF7，SELL)。GZMK− γδ T 细胞具有与 GZMK γδ T 细胞相似的转录组，它们与2个效应亚群（CD4_TE 和 CD8_TE）聚集在一起。此外，MAIT 细胞与 GZMK γδ T 细胞聚集在一起。这些 T 细胞群体都在体内发挥直接的细胞毒性作用。最后，在 B-ALL 患者中，两个耗竭性的亚群（CD4_Exhau 和 CD8_Exhau）明显聚集在一起(Figv1E)。
Fig1 E
2.不同的 T 细胞亚型在 B-ALL 中普遍表现有更多的激活特征
接下来，接着他们将健康个体和 B-ALL 患者的所有 T 细胞结合起来分析。健康个体中中 11 个 T 细胞亚群与 B-ALL 患者中的相应的亚群聚合在一起展示（Fig 2A）。成对 Pearson 相关分析还表明，两组患者的 T 细胞簇具有相似的表达模式（除了CD4_Exhau 和 CD8_Exhau，Fig 2B）。
Fig2 A and B
他们进一步分析了健康个体和 B-ALL 患者中 T 细胞的细胞周期阶段。在健康个体中，T 细胞大部分保持在 G0/G1 状态，B-ALL中有大约20.4%T细胞处于增殖状态(FigS3 C and D)。
FigS3 C and D
他们发现CD4_Exhau 和 CD8_Exhau是增殖率最高的种群（分别为 41.7% 和 31.1%）（Fig 2C）。这与其他研究一致，表明耗竭性 T 细胞是主要的免疫细胞增殖场所。
Fig1 C
接着，为了探索不同 T 细胞亚群对 B-ALL 疾病的发生发展关系，他们将白血病患者与健康个体（除了CD4_Exhau 和 CD8_Exhau）的T细胞亚群进行比较。首先确定每个群中的差异表达基因（DEG），然后在 B-ALL 中，对 DEG 进行通路富集分析。他们观察到上调的基因参与了抗原呈递（HLA-DQA1 和 HLA-DQB1）、T 细胞激活（CD27 和 CTLA4）、细胞毒性（GNLY 和 GZMB）、致癌基因激活（RHOA 和 CBLB）以及细胞因子介导的信号通路的基因类别(IL2RG 和 IL7R) (Fig 2E)。下调的基因涉及核糖体生物发生（RPL 和 RPS）和缺氧反应（CYBA 和 ND4）（Fig 2F）。总的来说，B-ALL 中的 T 细胞差异基因相关通路大多数是激活状态，表明处于B-ALL环境中的的 T 细胞被重塑化，导致它们的抗原呈递和免疫毒性通路增强，从而去除恶性细胞。
Fig2 E and F
3.B-ALL 中耗竭 性T 细胞的转录组学异质性
接着他们重点放在耗竭性T细胞亚群上。首先 CD4/CD8耗竭性T细胞亚群可进一步细分为10个亚群（Fig 3A）。这10个亚群显示表达不同水平的耗竭性marker，并且与细胞周期状态、naive状态或 GNLY 表达相关等表达模式组合时，每个亚群似乎并不重叠或者说互相靠近。Ex_CD4 和 Ex_CD4_GNLY 、Ex_CD8 和 Ex_CD8_GNLY 、Ex_CD4_cc 和 Ex_CD4_cc_GNLY ，以及 Ex_CD8_cc 和 Ex_CD8_cc_GNLY 可根据GNLY 表达水平区分开来（Fig 3C）。
Fig 3 A and C
Ex_CD4 和 Ex_CD4_GNLY 、Ex_CD8 和 Ex_CD8_GNLY 、Ex_CD4_cc 和 Ex_CD4_cc_GNLY ，以及 Ex_CD8_cc 和 Ex_CD8_cc_GNLY 被 GNLY 表达水平区分开来（Fig 3C）。此外，GSEA比较了四个耗竭性的 GNLY 亚群（Ex_CD4_GNLY 、Ex_CD8_GNLY 、Ex_CD4_cc_GNLY 和 Ex_CD8_cc_GNLY ）通路富集变化。结果表明， GNLY 的亚群在 TCR 信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和细胞因子-细胞因子受体相互作用中被激活（Fig S4D）（备注：原图不清晰，所以没放上来）。因此，他们得出结论，T细胞的GNLY 的表达量与其具有更高的细胞毒性能力呈正相关。总的来说，耗竭性T 细胞应被视为一个具有异质性质的“细胞室”，里面由处于不同状态的 T 细胞组成，可能具有不同的生物学功能。
然后，他们将耗竭性 CD8 T 细胞群与 CD8_Naive、CD8_EM、CD8_CM 和 CD8_TE 群比较，耗竭性 CD4 T 细胞群与 CD4_Naive、CD4_Th、CD4_Treg 和 CD4_TE群进行了比较，然后取2组共同的差异基因，发现有 28 个耗竭特异性基因（Fig 3E）。除了几个已知的基因，包括 HAVCR2、PDCD1、LAG3 和 HLA-DRA，还包含几个鲜为人知的基因，包括 CXCR6、ITM2A、SH2D1A、CD38、CBLB 和 TIMD4（Fig 3F）。已知在TCGA的AML数据中，CXCR6、CD38 和 CBLB 的高表达与不良预后相关。最近的报道表明，ITM2A 的高表达与卵巢癌的不良预后相关，而TIMD4 可能为提高癌症免疫治疗的临床疗效提供一种新策略。因此，他们的数据不仅证实了先前确定的基因与耗竭性 T 细胞有关，而且也可以识别用于诊断和免疫治疗的潜在生物标志物。也就是说，他们测的数据是可靠的。
Fig3 E and F
4.TCR分析表明 B-ALL 患者存在广泛的 T 细胞转变
接下来进入TCR部分。为了确定 B-ALL 状态下发生克隆性 T 细胞扩增的程度，他们对 B-ALL 患者的 T 细胞进行了克隆分析（Fig 4A）。（备注：3种颜色对应3个 TCR 克隆扩增组，其中“> = 3”表示至少有三个 T 细胞表达相同的 TCR 克隆型，“2”表示有两个 T 细胞表达相同的 TCR 克隆型，“1” ”表示只有一个 T 细胞表达的 TCR 克隆型)。
Fig4 A
首先，他们分析两组样本 TRA-CDR3(TRA-CDR3) 和 TRB-CDR3的 V(D)J usage and length 。发现健康个体和 B-ALL 患者之间 CD8_TE 簇中的 CDR3 长度存在差异（Fig S5A）。B-ALL疾病的 T 细胞具有更多样化的克隆型，克隆性高的群体主要集中在 CD8_TE 和 CD4_TE 群体中（Fig S5B），表明疾病中抗原的暴露导致免疫系统异常激活。
FigS5 A
FigS5 B
他们还发现TCR 克隆型组成在患者之间差异很大（Fig S5C）。每个患者都受到少量 T 细胞克隆的强烈支配，表明某些 T 细胞克隆扩增很高。
FigS5 C
克隆扩增的细胞主要处于 G0/G1 期，并高度表达细胞毒性效应分子颗粒酶 B 和 H（GZMB 和 GZMH）、FGFBP2、GNLY、NKG7、KLRD1 和趋化因子 (CCL5)（Fig 4B and C）。
Fig 4B and C
富集分析表明，这些细胞更多地参与抗原加工和呈递、淋巴细胞活化、免疫反应和细胞防御途径（Fig4 D）。
Fig 4D
CD4_Naive 和 CD8_Naive 显示出较少的克隆扩增。CD8_CM、Th 和 Treg 群表现出最小的克隆扩增。高克隆扩增主要集中在 CD4_TE、MAIT、CD8_TE、CD8_EM 和耗竭性亚群中（Fig4 E）。
Fig 4E
Pearson 相关分析评估了每个亚群中克隆组合之间的关系（Fig4 F）。发现4个耗竭性CD4 T细胞群聚集在一起，4个耗竭性CD8 T细胞群也聚集在一起，表明它们具有相似的TCR特征.
Fig4 F
而且CD8_EM 和 CD8_TE 之间也聚集在一起。与其他 T 细胞亚群相比，这2群（CD8_EM 和 CD8_TE）与耗竭性 CD8 群体共享更多的TCR。耗竭性群体与 CD8_TE 和 CD8_EM 之间共享的克隆数分别为 30/2133（1.41%）和 28/2133（1.31%）。而其他 T 细胞簇也与耗竭性群体共享“有限”的 TCR（Fig 4G）。这些数据表明，不同的 T 细胞亚群绝不是完全孤立的，它们可能会经历广泛的状态转换。他们推测耗竭性CD8 、CD8_TE和CD8_EM细胞群体可能具有相同的来源或者说是分化途径有交联。同样地，耗竭性CD4 簇和CD4_TE也存在这种情况。
Fig4 G
总结
这篇文章的讨论部分我展示一点，其他的大家有兴趣的话可以去看原文。作者他们发现B-ALL中有2群特异性的耗竭性T细胞亚群（CD8_TE 和CD4_TE ），而且耗竭性T细胞亚群不是离散状态，而是包含了不同的状态。有一些耗竭性细胞群体显示出细胞毒性评分较低的navie特征，而其他细胞表现有较高的增殖分数，并且耗竭评分相对较低。已知，naive样的耗竭性T细胞在经过抗检查点治疗后会大量增殖。他们推测这些细胞可能只是在耗竭程序积累期间开始出现增殖特征，而随着时间的推移会逐渐失去了它们的增殖特征。例如在2019年cell的一篇黑色素瘤的文章中(PMID:PMC7253294),可以看到，CD8 T细胞实际上处于高度增殖，克隆和动态分化的阶段，而这种高度增殖能力主要与功能失调程序的初始启动积累有关，而更advanced的功能失调性细胞则失去了这种增殖特征。
PMID:PMC7253294
总的来说，这篇文献揭示了B-ALL中CD45 CD3 T细胞在聚类，免疫活性和异质性方面的详细特征，描绘的B-ALL中T细胞的表征将有助于更好地了解基于免疫疗法靶向B-ALL有效性的潜在机制。
