Whole-genome and multisector exome sequencing of primary and post-treatment glioblastoma reveals patterns of tumor evolution
Genome Res. 2015 Mar IF：9.944
导语
GUIDE ╲
胶质母细胞瘤（GBM）是一种典型的异质性脑肿瘤，常规治疗难以治愈。手术和放化疗后还有少量残余癌细胞，导致复发，90%在原发部位复发。了解这些残余细胞的分子结构对寻找成功的治疗方法至关重要。与之前关于GBM的多区域取样分析（解决两个问题:（1）初始肿瘤的突变与随后复发的肿瘤的差异有多大?（2）化疗与一种常用于治疗胶质瘤的药物替莫唑胺(TMZ)，会如何影响肿瘤复发的突变?不同的是，本工作重点研究原发肿瘤的基因改变如何影响肿瘤细胞的进化和亚克隆异质性。
背景介绍
在一个肿瘤内存在多个癌细胞克隆，这个过程称为达尔文过程，不同的克隆争夺有限的资源，表型最合适的细胞最终存活。癌细胞异质性可使肿瘤对外界刺激（如治疗干预）作出反应。利用单细胞测序或大规模并行测序，可以在乳腺癌、肾癌和血癌等肿瘤谱系中对克隆结构进行描述分析。在GBM中发现了与酪氨酸激酶受体镶嵌扩增相关的特异的亚克隆肿瘤细胞群，表明该疾病具有类似的动态结构。
以EGFRvIII为靶点的治疗能够延长GBM患者的总体生存时间。然而，当肿瘤复发时，82%的病人EGFRvIII失去表达。这表明在这些肿瘤中，非EGFRvIII表达克隆具有竞争优势。因此，深入理解癌细胞的克隆结构是至关重要的。
数据介绍
cohort I：TCGA的252个未处理的GBM样本。
cohort II：23个原发和首次复发的配对样本。复发前，21患者接受放疗，其中17人接受TMZ辅助治疗。
结果解析
01
整合分析鉴定克隆和亚克隆突变
使用PyClone整合不同的等位基因片段、DNA拷贝数、基因型和肿瘤纯度对体细胞突变进行了分类，来研究GBM的克隆结构。校正肿瘤细胞含量后，用每个突变的细胞频率来推断突变的克隆性。克隆突变发生在恶化的早期或之前，存在于所有的肿瘤细胞；亚克隆突变发生在肿瘤扩展的后期，仅存在于肿瘤细胞的一个亚群中。在cohort I中检测到的17636个sSNVs中，67.9%是克隆的，29.8%为亚克隆。来自cohort II中将检测到的突变分为克隆或亚克隆，并将两种类型的sSNVs与空间分布进行了比较（Fig. 1A）。另外将病人分成年龄间隔10 的几组，发现克隆突变和年龄之间的显著线性相关（P = 3.69X10-7，多组方差分析）（Fig. 1B）。
Figure 1. 突变克隆性的推论和与患者年龄的关系。
（A）利用多区域测序验证克隆和亚克隆分类，分为四类（泛在/克隆、泛在/亚克隆、私有/克隆和私有/亚克隆）。
（B）克隆突变频率与年龄相关，而亚克隆突变频率与年龄不相关。
02
亚克隆突变与p53通路改变有关
p53通路的异常调控，尤其是TP53体细胞突变（n = 78）和MDM2扩增（n = 21），与亚克隆突变的比例增加密切相关（P = 6X10-5 ，Wilcoxon秩和检验） （Fig. 2A） 。G-CIMP阳性肿瘤是GBM的一个亚型，其特征是高甲基化、IDH1突变和TP53突变，因此亚克隆突变比例较高。亚克隆肿瘤组的无事件生存期长于克隆肿瘤组（P = 0.025，log-rank检验，年龄小于55岁的患者）（Fig. 2B）。在p53通路改变的GBM中，亚克隆突变比例增加可能意味着对DNA损伤或凋亡抑制的耐受高。
Figure 2：亚克隆部分与TP53突变及无事件生存的相关性研究。
03
复发的肿瘤中p53通路状态影响突变负担
对cohort II样本进行外显子组测序和DNA拷贝数分析。发现大多数原发GBM突变也可以在疾病复发后的肿瘤中检测到。
比较了诊断时和疾病复发后的突变频率，发现TP53突变型肿瘤和TP53野生型肿瘤之间存在不同的突变趋势（Fig. 3B）。
与匹配的原发肿瘤相比，TP53突变的复发性GBM亚克隆突变频率增加，而野生型TP53突变的复发性GBM亚克隆突变频率不增加（P = 0.0015；Wilcoxon秩和检验）（Fig.3C）。克隆突变频率不受影响 （P = 0.23；Wilcoxon秩和检验）。疾病复发后TP53突变的（而不是TP53野生型）亚克隆突变频率提高，进一步揭示了TP53突变与亚克隆肿瘤进展的关系。
Figure 3：原发性和复发性GBM的体细胞突变谱。
（A）外显子组测序检测的突变数量、临床特征、EGFRvIII畸变、CNV和体细胞外显子突变。只有常扩增、删除和突变的GBM基因才包括在CNV和突变组中。
（B）比较亚克隆和克隆突变在原发性和复发性肿瘤之间的频率。
（C）TP53突变与亚克隆突变负担的关系。
04
全基因组测序推断肿瘤的进化
为了全面报道GBM肿瘤的异质性和疾病的进展，本研究对cohort II的10个主要复发对进行了全基因组测序。
利用在每个肿瘤中检测到的大量突变，通过分析纯比例可变等位基因片段（purity-scaled variant allele fractions，PS-VAFs）的分布，来研究疾病进化的结构。理论上，PS-VAF 0.5的杂合突变是所有肿瘤细胞中都存在的克隆突变。分析后发现，GBM至少有两种明显的复发模式。以TCGA-06-0152（Fig. 4A）和TCGA-14-1034为例，验证了其来源于共同祖先细胞的模式。在该模式中，原发肿瘤和复发肿瘤共享一簇接近PS-VAF 0.5的克隆突变，同时原发肿瘤中的一簇克隆突变在复发肿瘤中消失。克隆突变的有限重叠涉及一个共同的祖先细胞，这个细胞导致了原发性和复发性肿瘤。在原发性和复发性特异性突变中，缺乏亚克隆突变的重叠以及PS-VAFs的广泛范围（0~0.5）表明，随后的两个疾病实例是独立进化的（Fig. 5A）。
TCGA-06-0125（Fig.4B）、TCGA-06-0190、TCGA-06-0221和TCGA-14-1402表现了不同的模式。在这些样本中，原发肿瘤和复发肿瘤的克隆突变高度重叠，而原发特异性克隆突变普遍缺失。在这些病例中，复发的肿瘤更有可能是由残留的原发疾病发展而来，特定的亚克隆被保留下来，并在肿瘤复发时扩大。这种基于残差的递归是动态的。例如，在TCGA-06-0221病例中，0.1 PS-VAF处的一个初级亚克隆进行了克隆扩增，导致复发时在0.5 PS-VAF处出现了一簇突变 （Fig. 5B）。
Figure 4：4对原发性和复发性GBM突变的综合比较。
Figure 5：肿瘤复发模式。
根据外显子突变谱构建的进化系统发育树显示，肿瘤原发区和复发区分属不同的分支，分离结构不同（Fig. 6）。在TCGA-06-0125中，导致复发肿瘤的肿瘤细胞来自原发肿瘤sector 2，与全基因组测序数据分析结果一致。类似地，在TCGA-06-0211中，该结构表明导致疾病复发的肿瘤细胞主要出现在sector 1。
Figure 6：基于原发和复发性GBM的多区域测序的系统发育树。
05
治疗性超突变是一个亚克隆过程
研究了替莫唑胺治疗在5例复发性肿瘤患者中诱发的超突变。大多数突变归类为亚克隆，通过对一个高突变复发性肿瘤的两次独立测序的活组织切片分析得到证实。分别观察到2429和5980个体点突变，但两次切片中只有163个共有突变。在该特异性肿瘤中发现MSH2、MSH6、MLH1、MLH3、POLD3等多个DNA错配修复基因发生突变。然而，这两种独立测序的活组织切片检查结果均不一致，这表明可能存在与这些基因无关并导致超突变的机制。
在第二次手术切除GBM肿瘤后，5名患者的生存期分别为35、64、107、191和245 d。超突变体的临床结果显示了GBM的致命性。
小编总结
本研究发现p53通路中基因改变是GBM中大量潜在的亚克隆突变。导致复发的基因组学过程是高度特异的，但可大致分为线性复发（与原发肿瘤有广泛的遗传相似性，可直接追踪到某个特定区域），分化性复发（与原发肿瘤几乎没有共同的遗传改变，且来源于肿瘤发生早期分裂的细胞）。本研究为原发肿瘤的基因改变如何影响肿瘤细胞的进化和亚克隆异质性的出现提供了见解。
方法整理
- 全基因组DNA测序BAM文件来自The Cancer Genomics Hub。
- 利用Burrows-Wheeler Aligner 0.7.2将外显子组测序序列与hg19进行比对。
- BAM文件使用Picard v1.7和GATK v2.4.9进行重复标记、indel重排和重校准。
- 使用MuTect算法 v1.14从肿瘤和正常样本中识别sSNVs。
- ANNOVAR 和Oncotator对所有sSNVs进行注释。
- GISTIC2算法被应用于分割的拷贝数表达谱以获得显著差异和肿瘤特异事件。252个GBM样本的GISTIC2的输出结果来自Broad GDAC Firehose。
- 通过PSCBS v0.28.1来确定配对肿瘤和正常样本的LOH。
- PyClone算法整合了参考和变异等位基因计数、LOH和拷贝数改变。
- ASCAT算法v2.1：推断肿瘤纯度、倍性和等位基因特异的拷贝数概况[Allele-specific copy number analysis of tumors.]
- SciClone是一种变分贝叶斯算法，从体细胞突变的VAF来推断肿瘤的亚克隆结构，关注CNN的变异、基因组LOH-free部分。
Ref：
Kim H， Zheng S， Amini SS， et al. Whole-genome and multisector exome sequencing of primary and post-treatment glioblastoma reveals patterns of tumor evolution. Genome Res. 2015;25(3):316–327. doi:10.1101/gr.180612.114
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