导语
GUIDE ╲
IL27在肿瘤免疫微环境中具有双重作用，既可以诱导免疫反应，又可以通过抑制免疫功能刺激肿瘤扩张。然而，IL27是否可以作为预测生存和免疫治疗反应的生物标志物尚不清楚。此外，IL27对肿瘤的双重作用机制尚不清楚。
背景介绍
继上次27分的单基因泛癌文章后，今天小编再为大家带来一篇非常容易复现的单基因单肿瘤的纯生信文章，与上一篇相似，本文也着重于单基因的免疫作用。发表于Front. Immunol.,影响因子7分 ，题目为Integrative Characterization of the Role of IL27 In Melanoma Using Bioinformatics Analysis。
数据介绍
从TCGA获取470例黑色素瘤患者的RNA-seq数据。临床资料包括年龄、性别、临床分期、肿瘤状态(有无肿瘤)、Breslow深度、Clark水平、病理分期、放疗反应、生存时间、生存状态。
合并5个黑色素瘤队列(GSE133713、GSE50509、GSE65904、GSE22155和GSE19234)验证IL27的生存。使用来自GSE65904的214例黑色素瘤患者的RNA-seq数据作为一个独立数据集，验证来自TCGA队列的RNA-seq数据产生的结果。
结果解析
01
IL27在黑色素瘤中的临床意义
IL27表达与Breslow深度呈负相关(Pearson相关性检验;R=-0.19, P=0.00042;图1A)，在329例Breslow深度值完全的患者中，有肿瘤的患者比无肿瘤的患者明显过表达(t检验;P=0.013;图1b)。此外，38例从放疗中获益的患者的IL27明显高于321例抵抗放疗的患者(t检验;P=0.038;图1C)，提示IL27可能与对黑色素瘤治疗的反应有关。
图1
鉴于IL27具有重要的临床相关性，作者对IL27进行了生存分析，发现高表达的IL27比低表达的IL27拥有更好的生存(log-rank检验;P=0.00016;图1d)。接下来，作者研究了IL27是否可以作为黑素瘤生存率的独立预测因子。以性别、年龄、Breslow深度、Clark水平、溃疡程度、病理分期、T、N、M、IL27表达为输入，进行单因素Cox回归分析。作者发现，年龄、Breslow深度、Clark水平、病理分期、T、N和IL27表达与生存结果显著相关(P<0.05)，因此将这些参数作为输入进行多因素Cox回归分析。结果显示IL27是改善生存结果的独立预测因子（HR:0.32-0.88,P=0.015;图1e)。
02
L27在GEO队列的验证
为了研究IL27在不同队列中的预后价值，使用log-rank检验在5个黑色素瘤队列中研究了IL27的预后相关性。IL27的高表达反映了五个验证队列中的三个队列无进展生存期(PFS;图2B, D, F)和总生存率的改善(OS;图2A、C、E)，以及在合并的5个队列也发生改善(图2I)，但是IL27在另外两个队列中没有预后价值(图2G, H)。
作者认为，这两个IL27与患者生存无关的队列的RNA测序样本是在患者复发时收集的，这些复发患者均曾接受过药物治疗，并发生了原发性或继发性耐药，导致复发。当耐药发生时，IL27的下游作用被阻断或减弱，而随着肿瘤的发展，IL27的表达可能由于负反馈机制而持续增加。IL27的高表达可能没有任何预后价值，或者可能与耐药患者较差的生存率有关，因为IL27的下游效应被阻断或减弱。
图2
为了证实IL27的作用可以被药物耐药所抵消的假设，利用RNA-seq数据和GSE50509组接受dabrafenib或vemurafenib治疗的黑色素瘤患者的生存数据分析了IL27的预后价值。不出所料，用药后IL27表达无明显预后意义，即使IL27表达高的患者接受dabrafenib或vemurafenib治疗，其预后也略差(图2J, K)。而IL27的高表达可以反映无进展生存期和总生存期的改善(图2E, F)。值得注意的是，作者发现治疗后IL27的表达没有改变(图2L)，提示药物治疗不影响IL27的表达，但可能影响了其下游效应。这些结果说明IL27的预后价值与其自身表达有关，并可被药物耐药所抵消。此外，也解释了IL27在癌症中观察到的相互矛盾的作用。
03
IL27的功能注释
作者接下来研究了IL27的生物学功能。首先，利用TCGA队列中黑色素瘤患者的RNA-seq数据进行IL27与其他基因的相关性分析。结果表明，有1047个基因与IL27显著相关(P<0.01)。其次，利用这1047个基因进行DAVID富集，获得了184个BP基因富集项、42个MF基因富集项、33个CC基因富集项和48个KEGG基因富集项(FDR<0.05)。作者发现所有的生物学功能和信号通路都与免疫相关(图3A-D)，暗示IL27参与了肿瘤免疫微环境。
图3
为了进一步评估IL27对信号通路的影响，利用来自TCGA队列的472例黑色素瘤样本的RNA-seq数据进行GSEA，获得了30个正相关的KEGG通路(FDR<0.05, NES>1)，包括自然杀伤细胞介导的细胞毒性、toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、nod样受体信号通路、rig-i样受体信号通路、JAK-STAT信号通路和凋亡(图3E，F)。
为了验证功能注释结果的可靠性，作者另一个独立数据集(GSE65904)进行验证。结果表明IL27主要参与了免疫应答，在TCGA和GSE65904的结果中有多个重叠的基因肿瘤学和通路。
接下来，作者解释了富集到的这些通路的意义。利用ssGSEA研究了IL27表达对细胞程序性死亡，包括焦亡、自噬和凋亡的影响。IL27表达与细胞焦亡(Pearson相关检验;R=0.64, P=1.2e-55)，自噬(Pearson相关检验;R=0.37, P=7.1e-17)、细胞凋亡(Pearson相关检验;R=0.47, P=1.1e-27)均显著相关(图3G)。使用GSE65904进行验证，发现IL27在该数据集中也与焦亡显著相关(Pearson相关检验;R=0.18, P=0.008)。
04
IL27生物学功能的验证
作者进一步探究IL27是否是免疫反应的driver基因。这里，作者使用了一个非常理想的数据集(GSE178142)，包括来自对照组小鼠(GSM5380810和GSM5380811)和IL27过表达小鼠(GSM5380806和GSM5380807)的RNA-seq数据。数据集共有233个差异表达基因，其中上调207个，下调26个(|logFC| > 2, P<0.01;图4)。
接下来，使用DAVID对207个IL27过表达小鼠的差异表达基因进行GO和KEGG分析，并与对照组进行比较。与上文结果一致，响应IL27的上调基因主要富集于免疫相关的生物学过程和通路(FDR<0.05;图4b, C)。
为了进一步验证IL27在人类癌症中对免疫应答的影响，作者研究了在人类前列腺癌(GSE32448)和黑色素瘤(TCGA-SKCM队列)中，响应IL27治疗的上调基因是否会与IL27共同阳性表达。正如预期的那样，响应IL27治疗的上调基因与IL27在人前列腺癌中(GSE32448;FDR=0.014, nes=1.47;图4D)和人类黑色素瘤(TCGA-SKCM;FDR=0.000, nes=3.33;图4E)中均阳性共表达，进一步支持IL27作为驱动基因。
图4
05
IL27与TME的关联
由于功能注释结果表明IL27参与了TME，作者进一步研究了IL27与TME的相关性。首先分析了IL27与IFNG、GZMB和免疫评分的相关性，已知这些与抗肿瘤免疫相关。IL27与IFNG、GZMB和免疫评分之间显著相关(Pearson相关检验;R=0.8, R=0.77, R=0.71;图5A-C)，表明其在抗肿瘤免疫中的作用。
为了全面表征IL27表达对免疫细胞的影响，作者使用ssGSEA估计每个免疫细胞的丰度，并比较了IL27高表达患者和IL27低表达患者的免疫细胞丰度。作者发现IL27高表达患者的免疫细胞明显富集(图5D)，暗示其具有促进免疫的作用。
图5
为了进一步验证IL27与抗肿瘤免疫细胞之间的关系，作者对IL27与抗肿瘤免疫细胞（包括gamma delta T细胞、自然杀伤T细胞、自然杀伤T细胞、树突状细胞、活化CD4 T细胞、活化CD8 T细胞和效应记忆CD8 T细胞）进行了相关性分析。有趣的是，IL27与这些免疫细胞水平显著正相关(P<0.0001;图5E)，进一步说明IL27在TME中的抗肿瘤功能。然后在GSE65904队列验证，发现IL27在该队列中也与这些肿瘤浸润免疫细胞显著相关(Pearson相关检验;R=0.34, R=0.28, R=0.23)，进一步强调IL27在抗肿瘤免疫中的作用。
CD8 T细胞/调节性T细胞(CD8/Treg)比值可以预测免疫治疗的疗效。作者证明了IL27确实与CD8/Treg比值呈正相关(P=0.02;图5F)，提示IL27参与免疫治疗效果。
06
L27免疫浸润
作者使用TIMER数据库检测了IL27表达与CD8 T细胞浸润之间的关系，并确定IL27确实与CD8 T细胞呈正相关(图6A) 。
作者进一步使用GSEA重新检测了IL27表达对T细胞浸润的作用。结果显示，高水平IL27患者的T细胞特征基因富集(图6B)，且IL27与T细胞浸润呈正相关(FDR=0.01, NES = 2.21;图6c)。
为了探讨IL27影响T细胞浸润的分子机制，利用GSEA分析了IL27表达与β-catenin信号转导的关系。据报道，β-catenin信号可以抑制TME中的T细胞浸润。结果显示，β-catenin信号通路相关基因在IL27水平较低的患者中富集(图6D)， IL27与β-catenin信号通路呈负相关(FDR=0.026, NES=-1.57;图6e)。
此外，为了验证IL27对β-catenin信号通路的影响，作者还分析了IL27与catenin信号通路的主要上游和靶分子(LRP6、DVL1、PSEN1、CTNNB1、GSK3B、APC、APC2、AXIN1、AXIN2、TCF12、MYC、FOSL1和VEGFA)的关系。与GSEA结果一致，IL27也与β-catenin信号通路成分负相关(Pearson相关检验;P<0.05;图6F)，暗示IL27通过抑制β-catenin信号通路刺激CD8 T细胞浸润。
07
L27可增强免疫治疗效果
由于上述结果提示IL27与抗肿瘤免疫相关，并可能与免疫治疗应答有关，作者研究了IL27表达对免疫治疗应答的影响。实体肿瘤可分为热肿瘤和冷肿瘤，其中热肿瘤对肿瘤免疫治疗有反应。基于热肿瘤特征基因(CCL5、CD8A、PDCD1、CD8B、CXCR3、CXCL9、CXCL10、CD4、CD3E、CXCL11、CD274、CXCR4)，采用无监督聚类方法将TCGA队列中的472例黑色素瘤样本分为热肿瘤样本和冷肿瘤样本（图7A-D)。然后，比较了热肿瘤和冷肿瘤之间IL27的表达，观察到IL27在热肿瘤中显著过表达(t检验;P<0.001;图7E)，表明它与免疫治疗的治疗反应有关。
为了进一步研究IL27的治疗价值，作者检验了IL27与多个免疫治疗应答预测因子的相关性，包括PD-1、PD-L1、TIGIT和IFNG(41,42)。与之前的结果一致，IL27被发现与这些分子具有临界相关性，相关效率在0.69到0.78之间(P <0.0001;图7f-i)。这些结果强烈提示IL27可能刺激肿瘤治疗的疗效。
图7
小编总结
本文详细探究了单基因IL27在单个肿瘤中免疫与临床作用。亮点在于本文讲述了一个完整的故事，分析比较全面，并使用多组独立数据集多次验证自己的结论。但是也有略微不足的地方，比如探究IL27是否是免疫反应的driver基因时比较牵强，如果有条件最好还是补充一下湿实验。总之，这篇7分的文章给我们做单基因提供了一个很好的模板，而且非常容易复现！！！
