导语
GUIDE ╲
鉴定CD8 T细胞相关因子和黑色素瘤的共表达网络，阐明黑色素瘤CD8 T细胞相关基因在微环境中之间的相互作用。
背景介绍
今天，小编和大家一起来学习一篇黑色素瘤中免疫检查点biomarker筛选的研究，这篇文章于2021年发表在《Frontiers in Immunology》期刊上，影响因子7.561，题目为:9-Gene Signature Correlated WithCD8 T Cell Infifiltration Activatedby IFN-g: A Biomarker of ImmuneCheckpoint Therapy Responsein Melanoma.
数据介绍
TCGA: SKCM-FPKM数据(470个样本)
GEO：GSE65904，包含214例黑色素瘤样本
GSE78220、GSE72056、GSE91061、GSE93157用于后续验证。
结果解析
01
CD8 T细胞浸润模块和基因的鉴定
作者在 TCGA-SKCM 和 GSE65904 中进行了聚类分析。TCGA-SKCM 中 178 个样本的聚类热图如图2A 所示，每个表型与共表达模块之间的相关系数如图 2B 所示。发现在TCGA-SKCM队列中，黄色模块与CD8 T细胞的相关性最强(Cor=0.69；P=1e-26)。黄色模块与CD8 T细胞之间的相关性图如图2C所示。
使用动态混合切割的方法建立了一个层次的聚类树。树上的每一片叶子代表一个基因，每个分支代表GSE65904中的一个共表达模块(图2D)。共生成15个共表达模块，并计算各表型与共表达模块之间的相关系数(图2E)。绿黄模块与CD8 T细胞之间的相关性图如图2F所示。
图2
接下来，作者根据模块相关性大于0.7和CD8相关性大于0.4来筛选两个模块之间的交叉因素。得到了22个基因（图3A）。随后在这22个基因中鉴定出了可能代表TCGA-SKCM和GSE65904共表达模块的核心基因。它们的蛋白质相互作用网络如图3B所示。这9个hub基因被标记为橙色的圆圈。我们对这些交叉因子进行了功能富集，发现干扰素反应最为显著，如图3C所示。
为了计算这些基因与CD8 T细胞浸润比例之间的相关性，作者根据TCGA-SKCM(图3D)和GSE65904(图3E)队列中9个基因表达值的中位数建立亚群。发现高表达组的浸润比例较高(P<0.05)，表明这些基因与CD8 T细胞的浸润有关。
图3
02
免疫微环境分析
作者选择了7个metagenes来分析这8个基因与免疫反应之间的相关性，它们代表了各种炎症和免疫反应。发现在TCGA-SKCM和GSE65904中，CCL5、GBP5、GZMA、GZMH、LAG1、NKG7、PRF1和PSMB10与其中7个簇呈正相关（图5）。以上结果表明，这9个核心基因与更强的T细胞反应和免疫反应相关。
图4
图5
03
生存分析和GSEA分析
为了分析它们对癌症特异性生存的影响，作者进行了生存分析。图6A、B分别展示了九个基因在GSE65904和TCGA数据集中高地表达组的生存情况。
GSEA分析显示，T细胞受体信号通路、抗原加工和呈递、趋化因子信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性与高表达组相关(图6C)。作者发现这些生物学途径与免疫相关有关，都参与了肿瘤免疫。
接下来分析了这些共表达因子与其他类型癌症中CD8 T细胞浸润之间的相关性。在皮肤黑色素瘤、甲状腺癌、头颈部细胞癌、肝细胞癌和肺鳞腺癌中，CCL5、GBP5、GZMA、GZMH、IRF1、LAG3、NKG7、PRF1、PSMB10与CD8 T淋巴细胞浸润比例相关(图6D)。
图6
04
单细胞分析
为了确定这些基因来自哪个细胞，进行了单细胞分析。用SingleR对这些子集进行注释，比较结果发现PSMB10、GZMA、GZMH、PRF1、CCL5在CD8 T细胞亚群中的表达含量相对较高，证实了之前在TCGA-SKCM中的发现（图7）。
图7
05
9-基因signature癌症预后预测
根据 9-gene.signature ssGSEA 评分的中位数分组，作者发现 TCGA 和 GSE65904 黑色素瘤队列中 9-gene.signature高表达的患者预后更好。同时，还发现 9-gene.signature高表达组中的患者在 TCGA 的多种癌症中具有更好的预后（图8）。
图8
为了进一步探讨9-gene.signature的价值，作者分析了其与血管生成相关通路、伤口愈合相关通路、IFN-g相关通路等的相关性。结果表明，9-gene.signature与免疫反应、血管生成、IFN-g反应、IFN-g产生、IFN-g产生正调控、IFN-g反应、伤口愈合、伤口愈合参与炎症反应、血管伤口愈合正调控等呈正相关(图9A)。随后，通过对细胞溶解评分的9-gene.signature、特征血管生成基因组等进行单因素分析，发现9-gene.signature具有更显著的预后价值(图9B)。
图9
06
免疫组化组织的病理学分析
免疫组化检测显示，在两个恶性黑色素瘤标本中呈阳性，阳性率为100%。PSMB10在肿瘤组织中的染色强度较低，而PSMB10在正常组织中的染色强度较高(图10A-D)。同时，作者补充了15项黑色素瘤和旁组织的定量免疫组化分析，结果显示旁样本中PSMB10的IOD/Area较高(图10E)。然后将PSMB10基因表达与CD8 T淋巴细胞结合，绘制多组的生存曲线。CD8 T淋巴细胞水平高和PSMB10水平高的患者预后最好，而CD8 T淋巴细胞水平低和PSMB10水平低的患者预后最差(图10F)。
图10
小编总结
作者在研究过程中使用公共数据集做了一些常规的生信分析方法，如WGCNA，ssGSEA、单细胞分析和泛癌分析等，最后通过免疫组化对筛选到的结果进行进一步验证，实验方法也并不复杂，可见合理的干湿结合会让基本的纯生信分析大大增色！
