导语
GUIDE ╲
肝癌是世界上致死性排名第四的癌症，肝细胞癌(HCC)是肝癌中最常见的亚型。HCC患者在手术切除后5年复发率可达50%-70%，其中有70%的患者在2年内复发，即早期复发。单细胞测序可以揭示早期复发患者的肿瘤生态环境，可以探索HCC的免疫逃逸机制，有助于指导HCC免疫治疗。
背景介绍
今天，小编带大家学习一下2021年1月发表于Cell (IF:20.507)的文章，梳理一下：早期复发性肝癌的肿瘤微环境是如何影响抗肿瘤的免疫原性以及预后。
数据介绍
- Discovery cohort: 12例初治的肝细胞癌(HCC)患者的癌组织以及癌旁组织，6例早期复发HCC患者的癌组织以及癌旁组织，进行单细胞测序。
- Validation cohort: 4例同时具有原发灶和复发灶的癌组织、癌旁组织进行单细胞测序，47例同时具有原发灶和复发灶的癌组织及癌旁组织进行免疫组化和bulk RNAseq测序。
- 单细胞测序平台：10x Genomics
结果解析
01
原发性HCC和早期复发性HCC的单细胞图谱
共获得了16,498个细胞，聚类成如下细胞亚群：内皮细胞、肝星状细胞、HCC恶性细胞、髓系细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、NK细胞(图C-E)。
- 在大多数患者中，内皮细胞和肝星状细胞的比例都较少（图E）。
- 肿瘤组织中大部分的非免疫细胞都是恶性细胞，且高表达肝相关的基因ALB, TTR, APOA2（图E）。
- 不同患者之间的免疫细胞占比不同，说明患者之间免疫浸润的异质性（图E）。
02
早期复发性HCC呈现独特的免疫微环境
对髓系细胞进一步细分亚群，可将巨噬细胞细分为5个簇，单核细胞细分为2个簇，树突状细胞细分为3个簇，以及一个周期性细胞簇（图A-C）。
HCC的复发灶比原发灶浸润了更多的树突状细胞（图D），利用免疫荧光在Validation队列中进一步验证了该结论（图E-F）。
T/NK细胞可进一步细分为17个亚群，NK细胞可细分为两个亚群（NK CD16和NK CD160），CD4 T细胞可细分为4个亚群(CD4 CCR7, CD4 IL2, Treg FOXP3, and TregLAYN)，CD8 T细胞可细分为7个亚群（CD8 CCR6, CD8 NR4A1, CD8 GZMK, CD8 XCL1, CD8 CTLA4, and CD8 LAG3）（图A）。
这些亚群在复发HCC和原发HCC患者中均出现（图B）。
NK CD16（FCGR3A ）亚群在HCC原发灶中富集，且高表达了很多细胞毒性细胞、以及抑制功能的基因(HAVCR2，KIR2DL-1,KIR2DL-3)（图D）。
Treg FOXP3 细胞在HCC原发灶中富集，伴随着CD27, FOXP3, LAIR3的高表达。
Treg LAYN 细胞只在一小部分患者中出现（图D），且高表达LAYN, TNFRSF9以及ICOS（图C）。
周期性细胞同时表达了一些毒性marker，以及耗竭性marker，说明这两种状态的细胞均存在增殖能力。一部分周期性细胞只在原发 HCC中出现，说明复发HCC的免疫应答相对不活跃（图D）。
从整体上来看，早期复发的HCC中，CD8 T细胞的比例更高，而CD4 T细胞更低（图E）。
小结：在复发HCC中，DC比例增加，Tregs减少，增殖的T细胞较少，CD8 T细胞丰度增加。
03
HCC的CD8 T细胞发育轨迹
利用Monocle绘制HCC原发灶和复发灶的CD8 T细胞进化轨迹。
1）CD8 CCR6和CD8 NR4A1位于进化的早期，细胞会经历以CD8 GZMH和CD8 GZMK为特征的中间细胞毒性状态，最终达到以CD8 CLTA4和CD8 XCL1为特征的耗竭状态（图A）。
2）在分化的过程中，耗竭性的信号是上调的，而细胞毒性信号在初期是上升的，但随着转变的过程会逐渐降低。
3）比较HCC原发灶和复发灶的进化轨迹，发现HCC复发灶CD8 T细胞主要集中在进化的初期，而在细胞状态转换以及进化的末端较少。而HCC原发灶中的CD8 T细胞主要分布在细胞毒性和耗竭状态的细胞中，位于进化的末端（图C）。
HCC的CD8 T细胞进化状态可总结为4个阶段：
- Phase 1：即进化的初始阶段，伴随着CCR6,CCR7,NCR3,KLRB1基因表达上调，而杀伤性功能的基因GZMA,GZMB,GZMH表达下调（图D）。能量代谢的分析显示，Phase 1细胞的功能依赖于脂肪酸氧化和有氧糖酵解，而不是氧化磷酸化。这也说明，Phase 1的细胞不同于经典的幼稚细胞，而是与记忆表型更密切相关（图E）。
- Phase 2：表现出肝脏驻留记忆T细胞的特征，高表达JUN、FOS、NR4A1、NR4A3基因（图F）。
- Phase 3：表现出效应T细胞的特征，高表达细胞毒性相关基因，而耗竭性基因表达较低。通路分析表明，Phase 3的细胞依赖于脂肪酸代谢，而脂肪酸代谢正是效应T细胞主要的能量来源。
- Phase4细胞高表达耗竭性基因。
随着CD8 T细胞进化的过程，HCC原发灶中只有BTLA表达升高，而LAG3和TIGIT的表达只在状态转换时有短暂的提升。说明CD8 T细胞在进化的过程中，免疫检查点在不同的状态下具有异质性（图G）。
尽管HCC复发灶和原发灶中处于Phase3的细胞比例相当，但它们属于不同的细胞毒性细胞簇，代表着不同免疫和转录状态，复发HCC样本与CD8 GZMH相关，原发HCC样本与CD8GZMK相关（图H）。
小结：原发HCC和复发HCC中的CD8 T细胞表现出类似的进化轨迹，但其免疫和转录状态却不同，暗示了在原发性和复发性肝癌的治疗中应考虑不同的免疫治疗策略。
04
早期复发的HCC中表现出CD8 T细胞的innate-like表型
进一步关注复发HCC中CD8 T细胞的转录状态，作者分别从组织驻留signature，细胞毒性signature, 共刺激signature, 耗竭性T细胞signature几个方面来分析。
在复发HCC中，组织驻留T细胞相关的基因（RUNX3, NR4A1，CD69）表达增加，而共刺激分子和耗竭性分子（TNFRS9, CD28, ICOS,TIGIT, CTLA4，HAVCR2）表达减少（图A）。
比较复发HCC和原发HCC的差异表达基因，发现在复发HCC中免疫抑制相关的基因显著下调（CD27, TIGIT, CTLA4, BTLA）（图B）。功能富集分析发现，复发HCC的CD8 T细胞对氧化应激的反应增强，表现为SOD1、SOD2、GADD45B、FOS、JUNB、NFKB1的表达增加（图C）。
在复发HCC中发现KLRB1 (CD161)和IL7R的 上调，表现出先天型和记忆型T细胞表型（图B），并在Cohort 2中免疫组化实验中验证了CD8 CD161 T 细胞在复发HCC中富集（图D-E）。
为了进一步评估这些细胞的效应功能，研究者利用流式细胞术进一步分离了肿瘤中的CD8 CD161 和CD8 CD161 - T细胞，并观察GZMB的表达水平，发现CD8 CD161 T细胞的GZMB丰度低于CD8 CD161- T细胞，表现出较弱的细胞毒性（图F-G）。
复发HCC中CD161 CD8 T细胞的富集与较高的二次复发率显著相关（图5H）。
综上所述，在复发HCC样本中CD8 T细胞以KLRB1过表达为特征，表现出一种先天样功能障碍状态，具有较低的细胞毒性和免疫抑制表型，这与在原发HCC样本中观察到的衰竭状态不同。值得注意的是，在复发和原发性HCC中，与klrb1高CD8 T细胞相关的基因表达特征的富集与不良预后和肿瘤进展相关。
05
在HCC复发早期，CD8 T细胞的克隆扩增减少
联合scRNA和scTCR，探索CD8 T细胞share的克隆情况，我们检测了CD8 T细胞的克隆扩增能力。在同一患者中出现至少一次相同的TCR clone，叫做clonal T细胞，clonal T细胞数目越多，代表克隆扩增越多。
复发HCC和原发HCC中，clonal CD8 T细胞的丰度类似，然而，当进一步探索这些细胞的增殖能力时，发现在HCC复发灶中只有较少的CD8 T细胞处于周期状态（图A）。
比较HCC原发灶vs癌旁的clonal CD8 T细胞比例，发现HCC原发灶中有更多的clonal CD8 T。比较HCC复发灶vs癌旁的clonal CD8 T细胞比例，发现两者之间无差别（图B）。
比较HCC原发灶vs癌旁的top 10 CD8 T细胞克隆比例，发现HCC原发灶中有更多的扩增克隆比例。比较HCC复发灶vs癌旁的top 10 CD8 T细胞克隆比例，发现两者之间无差别（图C）。
总的来说，HCC复发灶的CD8 T细胞没有明显的克隆扩增。
HCC复发灶中有67%的clonal CD8 T细胞与HCC原发灶一致，说明HCC复发灶中大多数CD8 T细胞都是与HCC原发灶针对相同的抗原（图D）。
对属于同一克隆群的CD8 T细胞，进行HCC复发灶 vs HCC 原发灶的表达谱比较，发现这些在HCC复发灶中功能失调的、非活性CD8 T细胞的状态来源于HCC原发灶的克隆，而这些细胞可能代表中央记忆型细胞（图E）。
小结：由于肿瘤的选择，HCC复发灶中CD8 T细胞克隆处于低增殖和无反应的状态，这些细胞可能无法识别和消除由肿瘤复发产生的亚克隆新抗原。
06
恶性细胞对早期复发性HCC的影响
比较HCC原发灶 vs HCC复发灶恶性细胞中的差异表达基因，发现在HCC原发灶中细胞周期相关通路上调，而在HCC复发灶中免疫应答的通路上调（图A）。
HCC原发灶中具有较高的增殖信号和较低的肝功能信号，而HCC复发灶中具有较高的免疫监测和逃避信号（图B），且观察到免疫逃逸相关的基因CD47在复发的恶性细胞中表达增加，且HLA/B/C表达水平升高（图C）。
小结：HCC复发灶具有较低的增殖率和较高的免疫逃避能力。
比较HCC原发灶 vs 复发灶的免疫检查点抑制剂表达情况，HCC复发灶中CD274（PD-L1）和CTLA4的表达更高（图D）。
在HCC复发灶中的确发现CD274 恶性细胞的占比更高（图E）。
进一步分析恶性细胞与树突状细胞的crosstalk，发现在HCC复发灶中，是通过CD274/CD80和CTLA4/CD80完成细胞通讯，但在原发灶中并未发现此现象（图F）。
小编总结
作者利用scRNA联合scTCR技术，对HCC原发灶和复发病灶进行单细胞水平的分析，去探索复发的原因。全文的亮点是，在早期复发肿瘤的CD8 T细胞中发现了KLRB1(CD161)的过表达，且表现出Innate-like的细胞功能，这些细胞可能与较差的预后有关。
Ref: Sun, Y. , et al. "Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma." Cell 184.2(2020).
END
