导语
GUIDE ╲
头颈鳞状细胞癌(HNSCC)是全球人类最常见的第六大恶性肿瘤，每年约有60万例新诊断病例。超过50%的HNSCC的患者被诊断时处于晚期，晚期HNSCC预后较差，治疗方法有限。免疫治疗由于其安全性和不良反应较少，可能会对晚期HNSCC患者产生更好的治疗效果
背景介绍
今天，小编给大家带来了在头颈部鳞状细胞癌中基于m6A甲基化调控因子进行肿瘤免疫微环境研究和预后模型构建的相关思路，这篇文章于2020年发表在《Molecular Therapy-Nucleic Acids》期刊上，最新影响因子8.886，题目为:Comprehensive Analysis of the PD-L1 and ImmuneInfifiltrates of m6A RNA Methylation Regulatorsin Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.
数据介绍
TCGA：528个HNSCC样本和43个正常样本。
GEO：GSE65858数据集为外部验证队列（包含表达数据和生存信息）
结果解析
01
m6A甲基化调节因子在HNSCC中的表达上调
为了评估m6A调节因子在HNSCC发生和发展过程中的生物学功能，作者基于TCGA数据集，研究了HNSCC和相邻正常组织之间15个m6A调控基因的表达模式。
分析所选的m6A调节因子的不同表达水平，HNSCC和正常组织中m6A调控基因的表达水平普遍存在差异上调（Fig.1A、B）。readers（KIAA1429，METAL3，RBM15，WTAP，ZC3H13和METTL16），writers（即HNRNPC，YTHDC1，YTHDF1，YTHDF2和YTHDF3）和erasers（ALKBH5和FTO）的表达水平在HNSCC组织中显著高于正常邻近组织。HNSCC组织中YTHDC2的表达水平明显低于正常组织。
这些结果表明m6A甲基化调节因子在HNSCC的发展中具有重要的生物学作用。
Fig.1
02
m6A调节因子一致性聚类与癌症患者的特征和生存显著相关
根据m6A调节因子的表达水平，将499例HNSCC患者分为两种亚型，即cluster 1（n=203）和cluster2（n=296）（Fig.2A）。cluster 2中个体m6A调节因子的表达低于cluster 1，特别是METTL3和HNRNPC的表达水平（Fig.2B）。
比较这两种亚型之间的临床病理特征（Fig.2B）。cluster 2主要包含女性患者，优先与低WHO等级（p<0.01）相关，并且免疫评分明显高于cluster 1（p<0.05）。cluster 2的总生存率（OS、p<0.0001）和无病生存率（DFS、p=0.009）比cluster 1的更长（Fig.2C、D）。
Fig.2
03
PD-L1与m6A 甲基化的关系
为了探讨PD-L1与m6A甲基化的关系，作者评估了两种亚型的差异表达以及PD-L1与m6A调节因子的相关性。
与正常组织相比，HNSCC组织中PD-L1的表达水平升高（p<0.05；Fig.3A）。cluster 2中PD-L1的表达水平明显高于cluster 1中（p<0.01；Fig.3B）。在TCGA队列中，PD-L1的表达与METTL3、RBM15、WTAP、HNRNPC、YTHDC2和YTHDF3的表达水平有显著正相关性，而与KIAA1429、YTHDF1和FTO的表达水平有显著负相关性（Fig.3C）。在GSE65858队列中获得了一致的结果（Fig.3C）。
Fig.3
04
与免疫细胞浸润相关的m6A调节因子的一致性聚类
为了研究m6A调节因子对HNSCC肿瘤免疫浸润的影响，作者评估了m6A调节因子表达上调的cluster 1和m6A调节因子表达下调的cluster 2之间的免疫评分和免疫浸润水平(Fig.3D和Fig.4)。这两个cluster显示免疫评分有显著差异（Fig.4A）。免疫评分较高的cluster 2的预后大于cluster 1的预后（p<0.05）。随后，分析两个cluster之间22种免疫细胞类型的比例。cluster 1显示CD4 naive T cell,CD4 memory-activated T cell, and eosinophils（Fig.3D、Fig.4B-D），而cluster 2与B memory cells, regulatoryT cells (Tregs), NK cells activated, monocytes,macrophages M2, dendritic cells activated, neutrophils, and mast cells相关（Fig.3D、Fig.4E、F）。
为了阐明导致两个亚群之间TIME差异的潜在调控机制，作者进行了基因集富集分析(GSEA)。结果表明，肿瘤的恶性特征包括G2M检查点（标准化富集评分（NES）=2.511、标准化p<0.001）、mTORC1信号（NES=2.456、标准化p<0.001）和PI3K/AKT/mTOR信号（NES=1.807、标准化p=0.003）与cluster 1相关（Fig.4G）。因此，PI3K/AKT/mTOR信号通路可能与cluster 1/2的不同TIME有关。
Fig.4
为了进一步验证，作者对“erasers”FTO和ALKBH5进行了一致性聚类。cluster 1中的OS比cluster 2更优（p=0.0012；Fig.5A）。然而，cluster 1的免疫评分和PD-L1的表达水平要低于cluster 2（Fig.5B和Fig.5C）。此外，两个cluster间22种免疫细胞类型的成分无显著差异（Fig.5D）。结果证明，去甲基化酶对生存和免疫浸润具有相反效应。
Fig.5
05
m6A甲基化调节因子预后signatures的构建与验证
为了准确地预测HNSCC患者中m6A调节器的临床结果，根据TCGA训练队列中15个m6A调节因子的表达值进行了LASSO回归分析，确定了7个m6A调节器，即METTL3、YTHDC2、METTL14、RBM15、YTHDC1、ZC3H13和HNRNPC，根据风险评分中值将患者分为高风险组和低风险组。
在TCGA训练和验证组中，7个基于m6A调节因子的signatures的风险评分、OS、OS status和表达水平的分布如Fig.6A和Fig.6B所示。热图表明，高风险m6A调节因子，包括METTL3、YTHDC2、RBM15和YTHDC1在高危组中表达较高，而保护性m6A调节因子包括METTL14、ZC3H13和HNRNPC在低风险组中表达水平升高。低风险组的OS比TCGA训练和验证组中的高风险组的OS要高（p<0.0001，Fig.6C、D）。
Fig.6
06
预后风险评分与HNSCC的评分、免疫评分和放射治疗相关
作者进一步分析了风险评分与临床特征之间的关系。热图显示了TCGA训练队列中高风险和低风险组中7个m6A调节因子的表达水平（Fig.7A）。高风险组中METTL3和YTHDC2的表达水平通常低于低风险组。在低风险组中，HNRNPC和ZC3H13的表达水平较低。高风险组和低风险组之间在聚类亚型（p<0.001）、等级（p<0.05）和免疫评分（p<0.001）方面的差异显著。
还进一步分析了风险评分与亚型、分类和免疫评分之间的关系。cluster 1的风险评分明显高于cluster 2（p<0.001，Fig.7B）。风险评分随着组织学等级的增加而增加（p<0.05，Fig.7C）。与低免疫评分组相比，高免疫评分组的风险评分较低（p<0.001，Fig.7D）。这些发现表明，风险评分与HNSCC患者的亚型、等级和免疫评分显著相关。
Fig.7
为了验证m6A调节因子在其他HNSCC病例中对免疫调节和生存具有相同的影响，我们从GEO选择了GSE65858数据集作为外部验证队列。与TCGA一致，低风险评分患者的OS更好（p=0.0025）（Fig.8A）。在GSE65858队列中使用3年和5年的ROC分析评估风险评分的生存预测（Fig.8B）。低风险评分患者始终具有较高的免疫得分（Fig.8C）。此外，还发现在TCGA训练、TCGA验证和独立GSE65858队列中，高风险评分患者比低风险评分患者的PD-L1表达水平下降（Fig.8D、F）
Fig.8
作者探讨了放疗的应用是否会影响HNSCC患者OS风险评分的预测性能。观察到高和低风险组放疗患者的OS更好（Fig.9、D），但高风险评分患者明显比低风险评分患者收益多。在高风险组中，放疗患者比无放疗患者具有良好的生存优势（Fig.9A、C）。放射治疗在低风险组的生存效益相对不显著（Fig.9B、D）。因此，高风险评分患者比低风险评分患者更容易从放疗中受益。
Fig.9
06
m6A调节因子特征的遗传改变对免疫细胞浸润的影响
作者分析了六种免疫细胞类型的风险评分与浸润水平之间的关系，来估计七种基于 m6A 调节因子的特征对 HNSCC 免疫微环境的影响。在风险评分和 B细胞（p < 0.001）、CD4 T细胞（p = 0.012）和 CD8 T细胞（p < 0.001，Fig.10A、C）的浸润水平之间观察到显著负相关。风险评分与中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞的浸润水平呈正相关（p < 0.001，Fig.10D、F）。
该结果证实了基于 m6A 调节因子的风险特征。
Fig.10
与 HNSCC 免疫微环境有关。进一步分析了基于 m6A 调节因子特征的体细胞拷贝数改变 (CNA) 对免疫细胞浸润的影响，以阐明风险评分与不同免疫细胞浸润相关的潜在机制.已鉴定的 m6A 调节因子特征的CNA，包括armlevel deletion和arm-level gain，显著影响了HNSCC中B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞的浸润水平（Fig.11）。这些结果表明 m6A 调节因子对 HNSCC 患者的 TIME 具有关键调节作用。
Fig.11
小编总结
本研究系统地评估了m6A 调节因子在HNSCC中的预后价值，与PD-L1的相关性，在TIME中的作用以及m6A RNA调节因子的潜在调节机制。基于m6A调节因子的风险特征与HNSCC患者的免疫细胞浸润水平显著相关。m6A甲基化可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路协同参与HNSCC免疫微环境的调节。
