导语
GUIDE ╲
前列腺癌位居男性发病率的第二位。从单细胞水平上了解前列腺癌患者的异质性和肿瘤微环境，可以了解疾病的发生和进展，也有助于筛选新型标记物并指导治疗。
背景介绍
今天小编给大家分享一篇由上海长海医院、加拿大多伦多大学和复旦大学附属肿瘤医院合作的单细胞研究，Single cell analysis reveals onset of multiple progression associated transcriptomic remodellings in prostate cancer，于2021年发表在Nature Cell Biology （IF=20.042） 杂志。在这项工作中，作者共分析了27个组织样本，获取了111,914个单细胞，提供了前列腺癌的单细胞基因表达图谱，该研究成果对前列腺癌的新型治疗策略以及标志物筛选具有重要价值。
数据介绍
Cohort 1: 12名前列腺癌患者，共13个组织样本。包含12个前列腺癌原发灶和1个前列腺癌淋巴结转移灶。测序平台：10x Genomics。
Cohort 2: 1名患者的原发前列腺癌病灶，以及2个（无淋巴转移的）髂外淋巴结。测序平台：BD Rhapsody。
Cohort 3：5个去势抵抗性前列腺癌病灶(CRPC)，6个前列腺组织作为对照组。测序平台：BD Rhapsody。
结果解析
01
前列腺癌的单细胞转录组图谱
作者对Cohort 1中的13个样本（12个前列腺癌原发灶和1个前列腺癌淋巴结转移灶）进行单细胞转录组测序，获得36,424个细胞，包括：基底/中间上皮细胞、Luminal细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞、T细胞、单核细胞(图1A，B)。
在Luminal细胞中，除了表达经典的角蛋白基因外，还观察到T细胞共刺激基因的表达(图1B)，说明Luminal上皮细胞参与了抗原呈递。
上皮细胞表达了更多的基因，而肿瘤微环境（即非上皮细胞）的复杂性更低(图1C)。
Luminal细胞中的CNV偏差明显高于其它细胞，说明非恶性上皮细胞也可能出现CNV的变化(图1D)。
不同患者的细胞类型组成各不相同(图1E)，其中Luminal细胞在大多数患者中都是主要的上皮类型。
02
前列腺癌上皮细胞亚群的分析
对上皮细胞进一步细分亚群，产生了16个细胞亚群(图2A)。
通过前列腺癌PAM50的signature，发现上皮细胞的cluster10和cluster12可能与前列腺癌进展相关。其中cluster10高表达了很多基底细胞/中间细胞的marker基因(KRT5, KRT14, KRT19, TP63)，而cluster12高表达了细胞周期相关基因(CDC20，CCNB1,CENPF,PTTG1)。
功能富集分析发现，cluster12细胞周期相关的细胞群富集在氧化磷酸化和DNA复制等功能上，而基底/中间细胞与抗原递呈相关(图2C)。
细胞周期的细胞群表达了更多的luminal B型，缺氧，PCS1特征，通过这些特征可以预测患者生存（图2D），但并不能说明细胞周期的状态是驱动因素。
基底/中间细胞表达了较多的luminal A型，且表现出较好的预后。在基底/中间细胞中，也表达了很多HLA II类基因以及趋化因子CCL2，且CCL2在基底/中间细胞的表达与TCGA bulk RNA中该基因的表达正相关(图2H)。
CCL2是一种趋化因子，可以招募巨噬细胞和T细胞等免疫细胞，作者进一步分析基底/中间细胞含量与巨噬细胞和T细胞浸润的关系，在TCGA bulk RNA数据中也观察到了很强的相关性(图2I)。
小结：基底/中间细胞能够吸引免疫细胞，因此推测：基底/中间细胞高表达的患者预后良好。
03
肿瘤相关巨噬细胞显示破骨细胞样特征
作者观察到两种不同类型的髓系细胞：单核细胞以及肥大细胞(图3A)。
对单核细胞进一步细分亚群，发现Cluster1表现出髓系来源的树突状细胞特征，而其它cluster则表现为单核细胞特征（CD14, FCGR3A）（图B-C），Cluster0, 2, 4, 5, 6表现出巨噬细胞特征(CD204)。
关注肿瘤相关的巨噬细胞时，观察到同时存在M1, M2两种亚型特征，且两种亚型具有很强的正相关(图3D)。但不同的巨噬细胞亚簇参与的生物学通路是不一样的，Cluster 6表现出破骨细胞(OC)相关通路的激活，如矿物吸收和溶酶体(图3E)。
04
浸润的CD8 效应T细胞表达肿瘤标志物基因
T细胞可进一步细分为CD4 T细胞、CD4 T调节细胞(Treg)、CD8 T初始细胞和CD8 T效应细胞(图3F，G)。
其中，Cluster 2, 3, 5均为CD8 效应T细胞，但表现出较强的异质性。Cluster 5的免疫及代谢活性较低，而Cluster 3的T细胞活性较强。
PSA（前列腺癌特异性抗原）是临床上常用的前列腺癌分子诊断标记物，它是由肿瘤细胞分泌的。KLK3是编码PSA的基因，在Custer3, Cluster5以及Treg细胞中, 均发现了KLK3基因的表达。伴随着KLK3表达丰度的升高，T细胞的细胞外囊泡(EV)活性也逐渐增强(图3H)。
05
起源于前列腺癌细胞的EV诱导T细胞表达KLK3
为了验证T细胞表达上皮肿瘤标记物KLK3是否只在前列腺癌的T细胞中出现，作者分析了另外四种癌症类型的单细胞转录组数据：头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)。在四种癌症类型中都发现了T细胞中肿瘤标志物基因KLK3的表达(图4A)，表明KLK3的高表达可能是浸润性T细胞的普遍特征。
作者通过流式细胞术和RT-PCR技术，验证了在T细胞中的确存在肿瘤标记基因KLK3的表达(图4B)。
为了探索肿瘤分泌的囊泡EV，是否会影响附近的淋巴结以及其影响程度，作者对Cohort 2的1例患者进行单细胞转录组测序。该患者有1个原发前列腺癌病灶，以及2个髂外淋巴结，且MRI和组织病理学分析均判定为无淋巴结转移。但单细胞的CNV分析显示，左侧淋巴结的上皮细胞与肿瘤细胞的CNV一致，而右侧淋巴结没有，推测该患者有轻微的左侧淋巴结转移(图4D，E，F)，且左侧淋巴结的T细胞中有大量KLK3表达。
CNA分析显示，一部分上皮细胞(84/153)含有与平均肿瘤CNA轮廓一致的CNAs，表示左LN有淋巴性微转移(图4H)。作者观察到KLK3在所有类型的细胞中广泛表达，最多的是T细胞，在左侧淋巴样本中表达，但在右侧淋巴样本中没有表达(图4I)。表明淋巴结中免疫细胞基因的改变可能发生在实际转移之前。
06
癌症相关的成纤维细胞及内皮细胞异质性
癌症相关成纤维细胞(CAF)在前列腺癌进展中起着重要作用，作者鉴定出948个成纤维细胞(图5A)，可细分为三个亚型(图5A，B)，其中VIM在3个亚组中均高表达。
作者对每个CAF亚型前150个上调基因进行了基因富集分析，3个亚型均富集到了血管生成相关功能，而与肌成纤维细胞、细胞黏附和细胞外基质(ECM)相关的功能(图5C)具有亚型特异性。
对于3,115个内皮ECs，可进一步分为6个亚群(图5D)，PECAM1在所有内皮细胞中均匀表达，FLT1的表达较少而PDPN无表达，说明内皮细胞来源于血管而不是淋巴管(图5E)。
Cluster2表达了S100A4，该基因可以促进肿瘤血管生成且与转移相关。Cluster3，4表达了THY1，该基因被报道表达于黑色素瘤的微血管内皮细胞且与转移相关，Cluster5同时具有THY1,ACTA2和S100A4的表达。
进化分析揭示了内皮细胞两种不同的命运，从cluster 0和1开始，一部分向cluster 3和4前进，另一部分向cluster 5前进，cluster 2是一种过渡态(图5F)，作者将这些高表达特征基因的内皮细胞成为活性内皮细胞(aECs)。
在cluster 0和cluster 1中最高富集的通路大多与免疫有关，而在活性内皮细胞(aECs)中最常见的通路是ECM受体信号传导和粘着斑通路(图5K)。
小结：活性的内皮细胞(aECs)可以改变ECM，同时降低免疫活性。
07
血管内皮细胞富集在去势抵抗性前列腺癌中，促进癌细胞侵袭
作者对Cohort 3中的3例前列腺组织和5例去势抵抗性前列腺癌组织(CRPC)进行了scRNA-seq分析(图6A，B)。通过进化分析，发现随着肿瘤进展至去势抵抗性前列腺癌，活性内皮细胞(aECs)的比例是逐渐增加的，而这些内皮细胞主要来源于去势抵抗性前列腺癌，说明活性内皮细胞亚群aECs与前列腺癌发展成去势抵抗性前列腺癌息息相关。
为了验证aECs与去势抵抗性前列腺癌的关系，作者收集了原发性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、正常前列腺组织，并通过流式分选技术分理出aECs，发现这些aECs主要来源于去势抵抗性前列腺癌组织。
共培养技术再次验证了aECs可以提高前列腺癌细胞的侵袭能力（图6H）。
小编总结
该研究通过单细胞测序对前列腺癌进行转录组分析，揭示了前列腺癌发生发展各个时期微环境各细胞亚群的变化，确定了疾病侵袭性的内皮细胞。发现了前列腺癌单细胞水平的分子分型标记物和与肿瘤进展相关的细胞亚型，该研究对前列腺癌新型治疗策略和肿瘤生物标记物的开发具有重大价值。
