单细胞RNA-seq (scRNA-seq)作为一种流行的工具，通过提供单细胞中单核苷酸分辨率的所有转录本的列表来绘制真核细胞状态图。在过去的几年中，scRNA-seq在人和小鼠细胞中广泛应用并取得重大进展。然而，微生物学的绝大多数研究仍然依赖于平均数千甚至数百万个细菌的批量测量。
来自德国亥姆霍茨感染研究中心（HZI）的研究人员在《Current Opinion in Microbiology 》发表了微生物群落scRNA-seq研究进展与挑战的综述，总结了对微生物群落进行scRNA-seq的新技术。
研究单一微生物中RNA含量的挑战
进行微生物的scRNA-seq主要受到技术障碍的限制。首先，需要获取微生物RNA。真菌和细菌将RNA封闭在细胞壁后，很难在没有酶解或机械破裂的情况下解离，细胞壁的多样性不能使用 "一刀切 "的解决方案。目前，还没有一种通用的方法可以以快速（<几秒）和高通量的方式简化单微生物裂解。此外，细菌的mRNA是非多聚腺苷酸化的，因此很难从核糖体RNA中分离出来，而核糖体RNA占所有RNA的90%以上。
微生物和哺乳动物细胞的主要物理特征
处理和记录微生物生理学的新方法
单细胞分析的第一步是微生物的分选和潜在的表型鉴定。荧光激活细胞分选(FACS)是一种稳健、方便、快速、高通量的分离单细胞微生物的方法。生物正交非正态氨基酸标签(BONCAT)也可探测遗传上难以处理的细菌，以将代谢活性细菌与非活性细菌区分开来，该标签可以识别细菌合成蛋白质。拉曼显微光谱(RACS)与微流体和光镊结合可以根据活性细菌代谢氘的能力对来自复杂的肠道、土壤或海洋的微生物群落进行分类。但是FACS和RACS因为缺乏微生物的表型成像（形状或大小）而不能对其进行分类。新一代基于微流体的设备已经出现，可以操作和研究单个细菌、古细菌和真菌。
然而，所有这些方法都只能对细胞表型进行终点分析，单细胞分离随时间推移成像(SIFT)是一个综合的平台，它结合了在均匀稳定的生长条件下连续几代的长期细菌培养、时间推移成像、光学捕获和下游基因组学分析的收集。此外，微流控技术正在给肠道细菌的培养带来革命性的变化。
原生动物、真菌和单菌的scRNA-seq
微生物scRNA-seq方法概述
原生动物
原生动物因为其高度灵活的基因组，使它们能够适应多种宿主并逃脱宿主的免疫。Smart-seq方案，如Smart-seq v4/ Takara、Smart-seq2、Smart-seq/C1，已被证明是通过最大限度地减少脱落来生成哺乳动物细胞scRNA-seq的一些最稳健方案。由于它们通常比其他方案更敏感，已被用于研究原生动物寄生虫疟原虫和锥虫的转录组。
真菌
与原生动物不同，真菌有细胞壁，每个细胞只有1~3pg的总RNA（比哺乳动物细胞少10倍），因此需要特殊的RNA提取程序。最近的报道介绍了三种在酵母模型生物上实现scRNA-seq的方法：Smart-seq/C1、YscRNA-seq和SCRB-seq。
基于 scRNA-seq的酵母转录组检测方法
单菌
细菌的RNA含量比单个哺乳动物细胞和真菌的RNA含量低10到100倍， 由于mRNA的转录物没有被聚腺苷酸化，因此将mRNA与核糖体RNA区分开来还面临另一个挑战。
多重退火和基于dC尾的定量单细胞RNA测序(MATQ-seq)，通过提高逆转录效率和随后PCR扩增子的产生来增加RNA-seq的灵敏度。作为一种补充方法，微生物分裂池连接转录组(microSPLiT)和原核表达(通过原位标记RNA和测序(PETRIseq))建立在基于组合索引的scRNA-seq方案的基础上，以同时分析数千种细菌。
由于主要病原体可以在细胞内环境中建立其生态位，因此开发能够在单细胞水平上同时在宿主和细菌中执行转录组学的双RNA-seq方案将是揭示致病机制的关键。CEL-seq2是一种采用线性扩增的常用测序方法，已被用于捕获感染约10个细胞内沙门氏菌细胞的巨噬细胞的转录组；此外，研究人员还开发了专门捕获病原体的探针PatH-Cap。
单菌单细胞双RNA-seq方案
由于scRNA-seq方案容易出现漏检的情况，而单分子荧光原位杂交(smFISH)仍然是定量转录物的金标准。开创性的工作已经利用smFISH在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的主要细菌模型中追踪单细胞水平的基因表达。最近的进展是开发了MERFFISH和seqFISH技术，这些技术在灵敏度和空间分辨率方面都有所提高，为开发细菌基因组级别的 FISH方法铺平了道路。
微生物scRNA-seq正在蓬勃发展，并在过去两年中利用模式生物和主要病原体进行了关键研究。虽然单原虫(疟原虫和锥虫)和单酵母RNA-seq似乎已趋于成熟，但单菌RNA-seq(针对革兰氏阴性和革兰氏阳性物种)仍在兴起。目前概念验证阶段接近完成，但还需要转向对自然微生物群的研究。此外，使用基于CRISPR的方案进行单个细菌细胞的有效裂解和rRNA耗尽将需要与基于微流控技术的设备一起开发，以简化样品处理。微生物组可能具有明确的空间组织，在健康和疾病中具有相关的功能，需要结合scRNA-seq和成像技术来解读微生物组织的模式。最后，定义微生物亚群在空间和时间中的作用将是以物种特异性方式设计靶向治疗方法的关键。
参考文献
Imdahl F, Saliba AE. Advances and challenges in single-cell RNA-seq of microbial communities. Curr Opin Microbiol. 2020 Oct;57:102-110.
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