scRNA-seq是表征样本中单个细胞转录组的主要技术，然而scRNA-seq技术间存在显著差异，每种技术都有其最适合的应用场景。来自西班牙、瑞典、英国、德国、澳大利亚等多国研究团队共同对13种scRNA-seq方法开展基准测评，相关研究成果已发表在《Nature Biotechnology》杂志。
实验设计
测评样本：这组细胞主要是人外周血细胞（60%）和小鼠结肠细胞（30%），但也包含少量HEK293T、NIH3T3和MDCK细胞。其符合如下条件，1）具有各种频率的高度异质性的细胞类型；2）基因表达有细微差异的密切相关的亚群；3）具有可追踪标记的确定的细胞组成；4）来自不同物种的细胞。
参与测评的技术：CEL-Seq2、MARS-Seq、Quartz-Seq2、gmcSCRB-Seq、Smart-Seq2、ddSEQ、ICELL8、C1HT-Small、C1HT-Medium、Chromium、Chromium(sn)、Drop-seq以及inDrop。
测评结果
研究人员根据检测细胞图谱和标志物表达的精确度来评估这些方法。他们使用了六个关键指标：基因检测、转录特征表达的总体水平、细胞簇的准确性、分类概率、数据整合后的细胞簇准确性以及可混合性。
总的来说，检测到人、小鼠和犬的细胞数量与参考样品的成分设计一致。除gmcSCRB-seq外，所有方案（1~9%）均检测到低浓度的犬细胞。此外，不同的方法在不同基因组位置之间的图谱统计显示出显著差异。
与较低的起始量（单核细胞和B细胞）相比，一些技术（例如Smart-seq2和Chromium v.2）在具有较高的起始量（HEK293T细胞）的检测方面表现更好。Quarts-seq2对三种细胞类型的基因检出都较高。
利用HEK293T细胞、单核细胞和B细胞的数据，研究团队观察到了强烈的技术特异性，特异性的主要来源是每个细胞检测到的基因数量。Quartz-seq2和Smart-seq2对所有细胞类型标志都有较高的表达水平，说明它们对细胞类型的鉴定有较高的能力。CEL-seq2和Quartz-seq2比其他技术识别出更多的基因。
为了进一步说明不同技术绘制复杂样本异质性的能力，研究团队在二维空间中对采样数据集进行聚类和绘制，然后计算聚类精度和平均轮廓宽度（ASW）。对于单核细胞，精确的聚类方法将主要亚群（CD14 和FCGR3A ）分开，而低ASW的方法没有区分它们。同样，有几种方法能够区分CD8 和自然杀伤（NK）细胞，而其他方法则不能。
Quartz-Seq2在基准测评中得分最高，本次测评显示：这些技术在库的复杂性和检测细胞类型标记的能力上存在差异，影响了它们的预测价值和整合到参考细胞图谱的适用性，其结果为个体研究人员和联合项目（如人类细胞图谱）提供了指导。
参考文献
Mereu E, Lafzi A, Moutinho C, et al. Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects[J]. Nature biotechnology, 2020, 38(6): 747-755.
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