2021年07月02日， Nature communications在线发表了复旦大学（中山医院）肝癌研究所樊嘉院士、杨欣荣教授团队与深圳华大生命科学研究院合作的最新成果Dissecting spatial heterogeneity and the immuneevasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma 。论文通过单细胞测序解析肝癌循环肿瘤细胞的时空异质性和免疫逃逸新机制。
此项研究的测序数据已存储于国家基因库生命大数据平台（CNGBdb），项目编号为：CNP0000095。
研究背景
肿瘤转移是一个多步骤、多环节的复杂过程，众多学者认为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）作为肿瘤转移复发的“种子”细胞，在这一过程中扮演极其重要的角色。CTC 定义为源自肿瘤原发灶或转移灶、存在于血液循环中的肿瘤细胞，在正常人体内几乎不存在。CTC在循环系统内的播散过程是一个时间和空间上的动态过程。这样推测CTC在其转移路径上存在着表型和分子上的差别（即时空异质性）。因此，仅针对外周血CTC的研究可能只是管中窥豹，露出的仅仅是在特定时间、特定部位CTC 的冰山一角，并不能全面反映CTC的时空特征。
研究内容
为了全面剖析CTC在整个循环播散时空过程中的特征变化及其背后的分子机制，作者决定对体内不同血管部位的CTC进行单细胞层面的深入研究。肝癌细胞从肝内原发灶脱落首先会经过肝静脉（hepatic vein, HV）释放进入下腔静脉，然后随血流进入心脏，再通过肺循环以后，CTC进入外周动脉（Peripheral artery, PA），经过外周毛细血管网，CTC流入外周静脉（Peripheral vein, PV），门静脉（Portal vein, PoV）则收集来自消化系统的静脉血再次流入肝脏。本研究共入组10例原发性肝癌行根治性切除手术的病人，在切除肿瘤之前，采集CTC从原发灶播散开始沿着循环路径上的这四个关键血管部位的血液，即肝静脉（HV）、外周动脉（PA）、外周静脉（PV）和门静脉（PoV）。将CTC阴性富集后，再通过单细胞操控机器人把单个未固定的CTC挑选出来，共成功分离295个CTC单细胞，进行单细胞全长转录组测序，完成转录组测序后（scRNA-seq）共获得113个质控合格的CTC单细胞转录组数据进行下游生物信息分析（图1）。
图1
首先，通过与配对原发肿瘤表达谱结果进行比对，分析发现CTC表达上调的基因涉及细胞迁移侵袭和免疫应答、细胞周期、细胞凋亡等信号通路。针对不同血管部位内的CTC异质性分析，首次观察到HV CTC的异质性最高，流入外周动脉以后CTC异质性显著降低，在外周静脉和门静脉内CTC的异质性再次升高。这一结果提示：① CTC是由原发灶不同克隆所释放的肿瘤细胞所构成，因此在肝脏流出道HV内的CTC存在很高的转录组异质性；② 在肺循环的毛细血管网滤过和动脉系统高剪切力的影响下，可能只有个头较小、细胞变形能力强以及抵抗流体剪切力强的CTC能生存下来，因而在PA中的CTC已经过筛选，异质性显著降低；③ 在外周静脉和门静脉内检测到的CTC由于在循环系统内“游荡”了很久，受循环中各种理化因素和生物因素的影响，如血流剪切力、失巢凋亡、低氧状态、细胞因子及免疫细胞等，CTC为了适应这些外在压力可能会主动激活不同的信号通路。因此，CTC在单细胞转录组水平表现为异质性也逐渐增加。
随后团队分别对相邻两个关键血管部位的CTC 表达谱进行差异基因分析，发现不同循环部位之间的 CTC 呈现出转录组的时空动态变化特征。从 HV 到 PA 的过程中，CTC 的整体转录活性降低；从 PA 到 PV 的过程中，CTC 的转录活性又逐渐增加。从 HV 到 PA 阶段，下调的基因富集在细胞生长和增殖等信号通路，包括 Myc 靶基因、G2/M 检查点相关基因、mTORC1 通路基因等；而上调的基因主要涉及上皮间质转化（EMT）、趋化因子、血小板激活等信号通路，这些信号通路的活化将赋予CTC抵抗免疫系统识别和攻击的能力，对于CTC的成功定植具有关键意义。当 CTC 从PA行至 PV 区域， Myc 靶基因的表达又开始上升，由于缺氧和 ROS 影响，糖酵解和氧化应激的通路开始激活。上述结果首次从单细胞水平揭示CTC可以通过主动调控其转录组活化或关闭相关信号通路来适应循环过程中所面临的各种环境压力，以达到“适者生存”进而成功实施转移的终极目标。
在CTC循环过程中所面临的各种环境压力中，免疫系统被认为是抑制 CTC 体内生存的关键“守门人”。原发肿瘤内存在大量浸润的免疫抑制细胞，如调节性 T 细胞（regulatory T cell, Treg）、骨髓来源的抑制性细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等，可抑制局部抗肿瘤免疫细胞的杀伤功能，如自然杀伤细胞和CD8 T 细胞等，形成有利于肿瘤细胞生存和发展的免疫抑制微环境。当肿瘤细胞离开原发灶进入血液循环后，肿瘤细胞便直接暴露在功能正常的免疫系统监视之下。与原发灶的免疫抑制微环境相比，血液循环内 NK 和 CD8 T 细胞抗肿瘤功能处于激活状态，可有效识别和杀伤进入循环中的肿瘤细胞。因此，CTC如何逃避免疫系统的监视和攻击是其成功实施转移复发的关键“限速步骤”。
为了探寻肝癌CTC免疫逃逸的关键基因，团队首先分析了肿瘤免疫逃逸相关基因和所有细胞因子基因在CTC和肝癌原发灶之间的差异表达，结果显示细胞因子CCL5变化幅度在CTC上调基因中位列第一，并且CTC从HV至PA、PV和PoV的过程中CCL5表达呈持续上调状态，结合既往研究中证实的CCL5具有招募Treg进而抑制抗肿瘤免疫的作用，推测CCL5可能是肝癌CTC实施免疫逃逸的关键基因；针对癌旁肝组织微血管内的CTC进行多色免疫荧光分析也证实了CCL5 CTC的存在，以及它们与CCR5 Treg的空间相邻关系，进而通过独立临床队列证实外周血CCL5 CTC与CCR5 Treg呈正相关；作者还对两个已发表的肝癌数据集进行分析，结果也证实 CCL5 表达与肝癌瘤内和门静癌栓（PVTT）中的 FOXP3（Treg标志物）表达呈正相关；进一步探索了CCL5 CTC 与循环Treg之间平衡的临床相关性，结果表明Treghigh / CCL5 CTChigh 肝癌病人术后预后最差。因此，作者推测CTC可能通过分泌CCL5来招募Treg实现对杀伤细胞的免疫抑制，进而逃避免疫杀伤，促进CTC播散和转移。随后系统的体、内外实验表明高转移肝癌细胞系（MHCC97H）中 CCL5 蛋白表达水平显著高于低转移肝癌细胞系（HepG2，Huh7 和 MHCC97L），同时MHCC97H上清招募 Treg的能力也显著强于Huh7上清，并且这种迁移活性可被CCL5中和抗体所抑制；小鼠转移模型也证实，CCL5敲减后Hepa1-6在体内清除速度较对照细胞显著增快，同时Treg 耗竭的小鼠清除Hepa1-6的能力也较对照小鼠更强，作者还发现CCL5敲减后Hepa1-6的肺转移能力显著降低；小鼠转移模型还证实敲减Hepa1-6的CCL5表达可以抑制Treg 募集，同时还可促进肝转移瘤中活化CD8 T细胞的浸润。体内和体外模型结果表明：CTC可通过主动分泌CCL5来募集Tregs，从而抑制杀伤性CD8 T细胞的功能，在转移定植过程中建立有利于其生存的局部微环境。
最后，团队探索了调控CTC CCL5表达的分子机制。为鉴定诱导CCL5表达的关键转录因子，我们分析了CTC内所有转录因子表达与 CCL5表达的相关性，结果显示正相关程度最高的转录因子是MYC-associated factor X（MAX）。GeneHancer预测结果提示MAX是能够与 CCL5 基因增强子结合的 TF之一；对CTC上调的基因集进行KEGG分析后发现p38 MAPK通路显著富集；同时，p38 MAPK信号通路中的多个关键基因，包括TAOK1，TAOK2，MAP2K3，PLA2G4A和 MAX 在CTC中均显著上调，提示CTC中的p38 MAPK通路呈激活状态；进一步的体内、外实验证实p38-MAX通路是调控CTC CCL5表达的关键信号通路，抑制p38-MAX通路可显著降低CTC的免疫逃逸和转移能力。
研究意义
综上所述，本项发表在Nature Communications的研究，首次从单细胞转录组层面证实了CTC在体内循环过程中的时空异质性；系统揭示了CTC动态调控相关信号通路以适应循环过程中所面临的各种环境压力；阐明了CTC通过活化p38-MAX信号通路诱导CCL5表达，进而招募Treg实现免疫逃逸的相关分子机制（图2）。本研究结果为进一步探索靶向CTC的抗肿瘤复发转移策略提供了新思路。
图2
复旦大学附属中山医院樊嘉院士、杨欣荣主任医师、深圳华大生命科学研究院侯勇研究员为本文共同通讯作者，孙云帆主治医师、吴靓博士、刘石平研究员、江苗苗博士、胡博主治医师为本文共同第一作者。
参考文献
Sun, YF., Wu, L., Liu, SP. et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 12, 4091 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-24386-0
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