RNA-seq数据分析完全指北-11：Spladder分析可变剪切

2022-04-08 17:36:48 浏览数 (2)

拖更了好久，有没有一年？我自己都不知道了

可变剪切，即alternative splicing, 指的是在mRNA前体到成熟mRNA的过程当中，不同的剪切方式使得同一个基因可以产生多个不同的转录本, 最终产生不同的蛋白质。由于结构决定功能，而序列决定结构，可变剪切可能会对蛋白质功能产生巨大影响。许多文献也表明，可变剪切在发育、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。

目前已经有非常多可以用于可变剪切的软件，包括JuncBASE、rmats、ASprofile、MISO、suppa、leafcutter等等等等。。。关于rmats和suppa，生信技能树和生信菜鸟团已经有了许多的教程。今天，我主要介绍另一个可变分析软件Spladder。

1、Spladder简介和安装

Spladder于2016年发表在《Bioinformatics》，也是后来2018年《Cancer Cell》上TCGA可变剪切数据综合分析使用的软件。Spladder可以识别5种可变剪切，包括（多个）外显子跳跃、3’端可变剪切、5‘端可变剪切、内含子保留和互斥外显子。

Spladder的安装也非常简单，直接通过pip安装就可以，只是目前尚不能通过conda安装。

代码语言：javascript复制
pip install spladder

Spladder具有三种运行模式，分别是build模式、test模式和viz模式。其中，build模式用于构建剪切图并识别可变剪切事件，test模式用于比较不同分组之间的可变剪切的差别，viz模式顾名思义用于可视化。

2、Spladder实际操作

对于实际数据，总的可变剪切事件的识别主要包括4个步骤。

  • 单个剪切图
  • 合并剪切图
  • 图定量
  • 可变剪接事件定量
代码语言：javascript复制
cat ../case | while read id
do
spladder build -o ./ -a ~/reference/gtf/hg38.gtf -b ../4.bam/${id}.bam --merge-strat single --no-extract-ase
echo ../4.bam/${id}.bam >> alignments.txt
done
sed -i ':t;N;s/n/,/;b t' alignments.txt

spladder build -o ./ -a ~/reference/gtf/hg38.gtf -b `cat alignments.txt` --merge-strat merge_graphs --no-extract-ase

cat ../case | while read id
do
spladder build -o ./ -a ~/reference/gtf/hg38.gtf -b ../4.bam/${id}.bam --merge-strat merge_graphs --no-extract-ase --quantify-graph --qmode single
done

spladder build -o ./ -a ~/reference/gtf/hg38.gtf -b `cat alignments.txt` --merge-strat merge_graphs --no-extract-ase --quantify-graph --qmode collect

for type in exon_skip intron_retention alt_3prime alt_5prime mult_exon_skip mutex_exons
do
spladder build -o ./ -a ~/reference/gtf/hg38.gtf -b `cat alignments.txt` --event-types ${type}
done

3、差异分析

对于许多实际数据来讲，都是两分组或者一个对照组对应多个实验组的实验设计。对于这种情况，我们就可以使用Spladder的test模式。

代码语言：javascript复制
spladder test --conditionA aligmmentA1.bam,alignmentA2.bam 
              --conditionB alignmentB1.bam,alignmentB2.bam 
              --outdir spladder_out

4、结果解读

在运行之后，Spladder会生成多种格式的文件，包括GFF3、HDF5和TXT格式的文件。其中，GFF3文件可在IGV或UCSC中进行可视化，而HDF5格式文件对于大多数人来说操作起来有一定的困难，所以主要可以关注TXT文件。

可变3’端/5‘端

对于这两种情况，除了染色体序号，所在基因和染色体 /-链信息以外，还有以下重要信息：

  • valid: 剪切事件可信，则为1，不可信，则为0；
  • e1_cov: 剪切事件中前一个外显子区域的平均覆盖度；
  • e2_cov: 剪切事件中可变区域的平均覆盖度；
  • e3_cov: 剪切事件中后一个外显子区域的平均覆盖度；
  • e1e3_conf: 跨越长内含子的剪切事件的数目；
  • e2_conf: 跨越短内含子的剪切事件的数目；

外显子跳跃

  • valid: 剪切事件可信，则为1，不可信，则为0；
  • e1_cov: 剪切事件中前一个外显子区域的平均覆盖度；
  • e2_cov: 被跳跃的外显子区域的平均覆盖度；
  • e3_cov: 剪切事件中后一个外显子区域的平均覆盖度；
  • e1e2_conf: 被跳跃的外显子到左侧翼外显子区域的剪切事件的数目；
  • e2e3_conf: 被跳跃的外显子到右侧翼外显子区域的剪切事件的数目；
  • e1e3_conf: 两侧外显子区域的剪切事件的数目；

内含子保留

  • valid: 剪切事件可信，则为1，不可信，则为0；
  • e1_cov: 剪切事件中前一个外显子区域的平均覆盖度；
  • e2_cov: 保留的内含子区域的平均覆盖度；
  • e3_cov: 剪切事件中后一个外显子区域的平均覆盖度；
  • e1e3_conf: 跨越内含子的剪切事件的数目；
  • e2_cov_region:覆盖度>0的区域占内含子的比例；

互斥外显子

  • valid: 剪切事件可信，则为1，不可信，则为0；
  • e1_cov: 剪切事件中左侧翼外显子区域的平均覆盖度；
  • e2_cov: 剪切事件中第一个被跳跃的外显子区域的平均覆盖度；
  • e3_cov: 剪切事件中第二个被跳跃的外显子区域的平均覆盖度；
  • e4_cov: 剪切事件中右侧翼外显子区域的平均覆盖度；
  • e1e2_conf: 从左侧翼外显子到第一个跳跃的外显子的剪切事件的数目；
  • e2e4_conf: 从第一个跳跃的外显子到右侧翼外显子的剪切事件的数目；
  • e1e3_conf: 从左侧翼外显子到第二个跳跃的外显子的剪切事件的数目；
  • e3e4_conf: 从第二个跳跃的外显子到右侧翼外显子的剪切事件的数目；

其实，还有很多细节我没有介绍到，具体内容可以参考官网的教程，Welcome to SplAdder’s documentation! — SplAdder 3.0.2 documentation。

参考文献如下：

  1. Kahles, A. et al. Comprehensive Analysis of Alternative Splicing Across Tumors from 8,705 Patients. Cancer Cell 34, 211-224.e6 (2018).
  2. Kahles, A., Ong, C. S., Zhong, Y. & Rätsch, G. SplAdder: identification, quantification and testing of alternative splicing events from RNA-Seq data. Bioinformatics 32, 1840–1847 (2016).
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