文献解读 | 8分+，单细胞基因组学+肿瘤微环境+预后

2022-04-09 11:10:01 浏览数 (1)

今天带来的是2022年1月份发表在Cell Death & Disease的一篇单细胞基因组学研究，主要探讨了四种类型的非透明肾细胞癌（nccRCC）单细胞景观，以及肿瘤微环境异质性与nccRCC的临床预后相关性。

1.期刊简介

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2.摘要

目的：非透明肾细胞癌（nccRCCs）具有组织病理学的异质性，在肾癌中较为少见。更深入地对nccRCC的肿瘤生物学进行研究，可以对其不同亚型提供更有效的治疗方式。

方法：为了揭示nccRCC中肿瘤微环境（TME）的异质性，对乳头状肾细胞癌（pRCC）、嫌色细胞癌（chrRCC）、集合管癌（CDRCC）和肉瘤性肾细胞癌（sarRCC）患者的肿瘤和正常组织进行了10×单细胞基因组测序。

结果：提出了四种类型的nccRCC的单细胞景观，并证明CD8 T细胞衰竭、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和肉瘤过程是nccRCC组织免疫抑制的关键因素，且与不良预后密切相关。此外，癌细胞和肿瘤浸润基质细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）中均存在异常的代谢模式。结合CIBERSORTx工具，来自 TCGA 的bulk RNA-seq 的表达数据用单细胞数据的细胞类型进行标记。细胞类型相对丰度的计算表明，在 274 名 nccRCC 患者队列中，耗竭的CD8 T细胞、TAMs和sarRCC衍生细胞的比例较大，与nccRCC的预后不佳相关。

结论：更深入地研究了nccRCC异质性和肿瘤生物学，可能有助于发现更有效的nccRCC治疗新方法。

3.材料方法

  1. 公开数据集获取
  2. 肿瘤和正常组织进行了10×单细胞基因组测序。
  3. 数据质量控制和细胞类型识别
  4. nccRCC组织免疫荧光
  5. 肿瘤纯度和免疫浸润分析‘
  6. 伪时间轨迹分析
  7. 差异表达和通路分析
  8. 细胞间通讯分析
  9. 单细胞调控网络分析
  10. 推断CNV
  11. TCGA的外部RNA-seq和临床数据验证

4.研究结果

1.nccRCC单细胞测序的细胞聚类

  • 图A-C,E：来自 5 名 nccRCC 患者的 14 个组织。在质量过滤后的剩余细胞中，27374 个来自肿瘤，7187 个来自非恶性样本。scRNA-seq 鉴定的16 种主要细胞类型：7种免疫细胞和9种非免疫细胞类型；
  • 图D： ESTIMATE算法结果显示肿瘤细胞具有较高的肿瘤纯度，免疫细胞具有较高的免疫评分，证明聚类的相对准确性。
  • 图F：气泡图显示每个细胞类型的top5主要基因标记物。

图1.来自 nccRCC 和正常组织的单细胞景观

2.与正常来源细胞相比，nccRCC 癌细胞在代谢和基因表达方面存在多样性和异常性。

  • 图A-C：nccRCC癌细胞和相应的正常来源的肾小管上皮细胞之间差异表达基因 (DEG)。 scRNA-seq的DEGs分析：上调或下调的DEGs有可能与代谢途径相关。 基因集富集分析（GSEA ）：①pRCC：只有它呈现PPAR通路被抑制，这可能是pRCC和ccRCC均起源于近端肾小管细胞（PT）。②CDRCC：糖酵解途径富集，而CD酸分泌途径被压抑；③chrRCC：癌症中的蛋白糖途径富集。
  • 图E：基因组变异分析（GSVA）表明，PPAR途径在PT中被上调。除了CDRCC，缺氧途径在所有的nccRCC细胞中都被上调，而CDRCC则呈现出活跃的脂肪生成。经典途径，P53，EMT和血管生成，在nccRCC细胞中都被上调。肿瘤糖酵解、谷胱甘肽代谢途径在nccRCC 细胞中上调。SCENIC和GSVA分析显示，NFκB途径在癌细胞中被上调。NFκB参与了T细胞的衰竭和抑制巨噬细胞对肿瘤发展的监视。
  • 图F：从这些类型的nccRCCs中获得高度异质性的拷贝数变异（CNVs），其结果与以前的研究接近。
  • 图G-H：细胞之间的相互作用：免疫检查点检测癌细胞与 CD8 T 细胞、巨噬细胞和内皮细胞的相互作用。TME 中 CD8 T 细胞、巨噬细胞和内皮细胞分泌的趋化因子与 nccRCC 细胞相互作用。nccRCC 细胞分泌的 VEGFA、PGF 和 IGF 与 CD8 T 细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞积极相互作用，这可能与血管生成有关。

图 2：nccRCC 发生异常的生物学过程

3.耗竭的CD8 T在nccRCC的TME中富集

  • 图A：CD8 T细胞被分为三个亚组；
  • 图B：气泡图中显示三个亚组细胞最重要的10个标志物；
  • 图C：检测到的免疫检查点涉及LAG3、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、TNFRSF9；
  • 图D：CD8 T细胞的分化轨迹：非恶性组织衍生的CD8 T细胞（亚组1）可分化为亚组2和亚组3。亚组3代表耗尽的CD8 T细胞，呈现在末端方向。亚组3表达更多与配体-受体对相关的免疫检查点，而亚组2具有更多的免疫的正常配体-受体对CD8 T细胞；
  • 图E：CD8 T细胞中:HAVCR2、LAG3、PDCD1、TNFRSF9高表达； 在nccRCC耗竭的CD8 T细胞亚群中，靶点HAVCR2/LAG3可能优于PD-1/PD-L1和CTLA4作为nccRCC的免疫治疗靶点。
  • 图G：亚组2和亚组3之间的DEGs；
  • 图H：三个亚组之间的TF，NFAT可能导致与T细胞功能障碍有关的基因上调；STAT3上调；
  • 图I：EOMES 和 NFAT5 在 CD8 T 细胞中表达增加，参与 T 细胞功能障碍；
  • 图J：GSEA 显示在耗尽的 T 细胞中富集的途径；
  • 图K-L：IHC分析：肿瘤旁和肿瘤之间CD8 LAG3 T细胞有可能作为nccRCC中关键的衰竭T细胞标志物；
  • 图M：GSVA ：NFAT、STAT3、CTLA4 和 PD1 以及其他可能激活的肿瘤通路在亚组3的细胞中上调。

图3：耗尽的 CD8 T 细胞在 nccRCC TME 中富集

4.巨噬细胞在 nccRCC 中起重要作用并呈现肿瘤浸润

  • 图A：与 nccRCC 细胞积极互作的巨噬细胞被分成五个集群；
  • 图B：小提琴图显示每个亚群的标志物：Normal_M的THBS1 ；pRCC_M的NDUFA4L2 ；chrRCC_M的SLC40A1 ；cdRCC_M的KRT8 ；和sarRCC_M的ATP5F1E 。
  • 图C：显示了TAMs标志物的表达
  • 图D：计算不同衍生巨噬细胞和正常巨噬细胞之间的DEGs ；
  • 图E：HAVCR2在chrRCC、pRCC和sarRCC衍生的巨噬细胞中高度表达。但免疫检查点PD1 和CTLA4 并没有发现有什么不同。因此，HAVCR2更有可能成为nccRCC的治疗目标，而不是PD1或CTLA4。此外，FGL2作为CD8 T细胞上FcγRIIB的免疫抑制配体，在chrRCC、pRCC高表达；
  • 图F：SCENIC分析：MAFG、ATF2和ATF4在Normal_M中上调，可能参与炎症的刺激；
  • 图G-H：IHC分析：与癌旁相比，在肿瘤组织中表达更高的 CD163 TREM2 ；
  • 图I：GSVA分析:大多数癌症相关通路在chrRCC_M中上调。

图 4：肿瘤浸润性巨噬细胞在 nccRCC TME 中呈免疫抑制状态

5.成纤维细胞在 nccRCC 中呈现异质性，内皮细胞由于衍生而表现出多样性

  • 图A：成纤维细胞被分为4个亚组；
  • 图B：每个亚组的特定标记：胎儿组（PLK2）、亚组1（NDUFA4L2 ）、亚组2（S100A8）和亚组3（THBS2）；
  • 图C：SCENIC 分析：亚组3 中的 CEBPD、FOXO3、FOXO1、CEBPZ 和 SMAD3 上调；
  • 图D：来自肿瘤或正常组织的内皮细胞被分为7个亚组，DEGs在图E中显示；
  • 图F：SPARCL1 和CRHBP 分别被鉴定为肿瘤和正常衍生的细胞；SPARCL1可以增加肿瘤的新血管生成和渗透性特征，并调节TME依赖的内皮细胞的异质性，CRHBP可以上调NF-κB和p53诱导的细胞凋亡来抑制ccRCC细胞的发展；
  • 图G：nccRCC中内皮细胞处于分化轨迹的末端，可以理解为正常来源的内皮细胞倾向于演变为肿瘤相关的细胞；
  • 图H-I：GSEA分析：RCC相关的通路，如EGFR、HIF-1、mTOR和VEGF，在肿瘤来源的内皮细胞中上调，表明nccRCC中TME的内皮细胞发生了血管或缺氧相关的疾病（图 5H, I）
  • 图J：GSVA分析不同衍生的内皮细胞的异质性，大多数癌症相关通路在肿瘤衍生巨噬细胞（C1 和 C4）中上调。

图 5：nccRCC TME 中成纤维细胞和内皮细胞的特征

6.在274例NCCRCC患者中，TME中的sarRCC细胞或渗透性免疫细胞与不良后果相关

  • 图A：CIBERSORTx计算每个亚组的相对丰都，用来评估亚组的临床意义；
  • 图B-D：TCGA nccRCC 患者的 Kaplan-Meier 生存曲线。CD8T_cluster3_cells （耗竭T细胞），chrRCC_macrophages, and sarRCC_cells都与较差的OS和PFS相关
  • 图E：Boxplots 显示：CD8T_cluster3_cells、sarRCC_cells 和 chrRCC 衍生的巨噬细胞在高 TNM 阶段富集；
  • 图F：构建临床预测模型，列线图显示了显着三个细胞亚组结合临床因素的预后作用；
  • 图G：为了进一步探讨免疫性TME的临床意义，将来自 TCGA nccRCC 的 nccRCC 患者通过ConsensusClusterPlus分为三个免疫亚组；
  • 图H：亚组3病人的OS较其他两组差；
  • 图I：亚组3的CD8T_clus-ter3_cells、chrRCC_macrophages和sarRCC_-细胞的相对丰度都明显高于其他两个亚组；
  • 这些数据指出了衰竭的CD8 T细胞、TAMs和肉瘤性RCC在nccRCC进展中的关键意义。

图 6：scRNA-seq 分析识别的 TME 细胞簇在 TCGA nccRCC 队列患者中的临床价值

小结

该研究以来自原发性肿瘤和转移部位的样本作为探索 nccRCC 的 TME 和异质性的基础。首次展示相对全面的 nccRCC scRNA-seq 景观，包括 pRCC、chrRCC、CDRCC 和 sarRCC。此外，作者又使用 TCGA 队列来验证异源细胞群的临床结果。研究描述的细胞类型特定标记表达模式可能有助于更好地理解 nccRCC 的 TME 异质性和生物学特征。

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