单细胞测序技术的产生对于生命科学研究无疑是个里程碑式的突破，不同于传统测序，单细胞测序是基于单个细胞的测序技术，而细胞是生命体发挥功能的最小单位，得益于单细胞极高的分辨率，研究者们可以精确识别每个细胞或细胞群所具有的特征，能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。
单细胞测序的应用领域相当广泛，肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等等。它也是高分文章的常客，Cell、Nature、Science上不同研究方向的单细胞测序文章比比皆是。可以说，了解了单细胞测序就了解了生命科学领域的最前沿发现。
今天就为大家解读Nature Medicine杂志上的一篇经典的单细胞高分文献，我们从文献入手，带领大家了解单细胞的应用方向。
内容很长，一定要看到最后！
Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment (肺癌肿瘤免疫微环境中基质细胞的表型特征)
背景知识
肿瘤具有广泛的异质性，但目前的大部分异质性研究主要限于癌细胞。这些研究揭示了一个非常复杂和多样化的肿瘤细胞图谱，并表明肿瘤细胞具有高度的基因多样化和克隆选择。然而，越来越多的研究表明，与肿瘤相关的基质细胞，如巨噬细胞、T细胞和成纤维细胞，以及它们为形成肿瘤微环境而建立的复杂的细胞生态系统，本身可能与肿瘤细胞一样复杂和异质。这种异质性的程度，它如何被肿瘤中的其他细胞塑造，反之也如何直接影响它们，仍然没有得到很好的描述。本文揭示了肺癌微环境的构成，从基质细胞亚群、信号通路、关键分子以及患者生存分析等多个层面开展研究。
文章简化流程
图标解读
a，样本来源
b，52,698个细胞的tSNE，每个细胞用颜色编码（从左到右依次）：样本来源类型（肿瘤或非恶性组织）；相应的病人；相关的细胞类型和在该细胞中检测到的转录本（UMI）的数量
c，不同种类细胞的marker。
d,（从左到右）：来源于4个非恶性样本和15个肿瘤样本的细胞比例；来源于5个病人中每个人的细胞比例；细胞数量和转录本数量的箱形图
a, 1,592个内皮细胞的tSNE图，按其相关的亚群（上）或来源的样品类型（下）进行颜色注释。
b, tSNE图按血液、淋巴、肿瘤和正常内皮细胞的标记基因的表达量进行着色。
c, 正常内皮细胞的29个标记基因或肿瘤内皮细胞的7个标记基因在来自正常肺（n = 108）、LUSC（n = 501）或LUAD（n = 513）的TCGA样本中平均表达。
d, 肿瘤和正常内皮细胞（n = 618和569个细胞，分别来自5名患者）之间通过GSVA对每个细胞的通路进行的差异分析。
e，内皮细胞的tSNE图，根据每个细胞中检测到的转录本的数量进行颜色注释。
f, 小提琴图显示参与血管生成和免疫激活的特定基因的表达，按正常或肿瘤内皮细胞亚群分类。
g, 使用SCENIC计算的转录因子表达调节的曲线下面积（AUC）得分的热图
h, 内皮细胞的tSNE图，用颜色注释（上图）MAF、FOSL1和TEAD1的表达（从左到右），以及（下图）这些转录因子的调节活性的AUC，对应于其靶基因的表达调节程度。
a, 1,465个成纤维细胞的tSNE图，按其相关的亚群（上）或来源的样品类型（下）进行颜色注释。
b, tSNE图，按亚群的marker基因的表达（灰色到红色）进行着色。
c, 每个亚群的成纤维细胞的marker基因在来自正常肺（n = 108）、LUSC（n = 501）或LUAD（n = 513）的TCGA样本中平均表达。
d, 小提琴图显示成纤维细胞亚群中编码胶原蛋白的特定基因的表达。
e, 通过GSVA对不同成纤维细胞亚群的通路的差异分析。
f, 每个成纤维细胞亚群之间用SCENIC预测的转录因子表达调节的AUC分数的t值热图。
g，成纤维细胞的tSNE图，用颜色注释（左）HOXB2和MEF2C的表达，这些转录因子的预测调节活性的AUC（中）和相关通路的GSVA分数（右）。
a, 5,603个B细胞的tSNE图，按其相关的亚群（上）或来源的样品类型（下）进行颜色注释。
b, tSNE图，按亚群的marker基因的表达（灰色到红色）进行着色。
c, 每个亚群的成纤维细胞的marker基因在来自正常肺（n = 108）、LUSC（n = 501）或LUAD（n = 513）的TCGA样本中平均表达。
d, 通过GSVA对从正常肺部或肺部肿瘤分离的滤泡B细胞（第1和第2群）的通路进行差异分析
e, 9,756个髓样细胞的tSNE图，按其相关的亚群（上）或来源的样品类型（下）进行颜色注释。
f, tSNE图，按亚群的marker基因的表达（灰色到红色）进行着色。
g, 每个亚群的髓样细胞的marker基因在来自肺（n = 108）、LUSC（n = 501）或LUAD（n = 513）的TCGA样本中的平均表达量。
h, 通过GSVA对从正常肺部或肺部肿瘤分离的巨噬细胞的通路进行差异分析
i, 每个成纤维细胞亚群之间用SCENIC预测的转录因子表达调节的AUC分数的热图。
j, 巨噬细胞的tSNE图，用颜色注释（左）IRF9和JUND的表达，这些转录因子的预测调节活性的AUC（中）和相关通路的GSVA分数（右）。
a, 24,911个T细胞的tSNE图，按其相关的亚群（上）或来源的样品类型（下）进行颜色注释。
b, tSNE图，按亚群的marker基因的表达（灰色到红色）进行着色。
c, 每个T细胞亚群的marker基因在来自正常肺（n = 108）、LUSC（n = 501）或LUAD（n = 513）的TCGA样本中的平均表达。
d, 通过GSVA对来源于正常肺部或肺部肿瘤的T细胞的通路进行评分。
e, 与d图一致，对CD8 T细胞的亚群进行评分。
f, 小提琴图显示参与T细胞活性和免疫检查点的特定基因在不同细胞亚群中的表达。
g, 1,704个CD8 T细胞特异性基因（相对于所有其他细胞过量表达>3倍）的表达量与平均颗粒酶表达量（GZMA、GZMB和GZMH）之间的相关性（TOP30）。
a, 每个肿瘤来源样本的肿瘤细胞分数和缺氧标志物基因表达。本研究包括的五个肿瘤被分成三份，每块都被标记为来源于核心、边缘或中间，介于边缘和核心之间。
b，线性模型的t值，显示肿瘤核心或边缘的基质细胞簇的富集。
c，TCGA-LUAD（n = 501）或LUSC（n = 513）样本中marker基因的平均表达量。
d，1,027个LUAD样本（左）或545个LUSC样本（右）中的marker基因表达（连续）与患者生存率之间的关系。
e，LUAD或LUSC患者（n = 1,027 或 n=545）的Kaplan-Meier生存曲线，根据注释的基质细胞标记基因的平均表达（二分类：高、低）分层。
文章的优点：
这篇文章非常能够代表单细胞研究的特点：
- 单细胞可以分出不同的细胞群，继而可以发现新的细胞亚群；
- 不同细胞亚群的功能之间是否存在不同，是否存在不同的分化状态，哪些基因的表达可以代表不同的细胞状态；
- 不同的细胞亚群和临床表型之间有什么联系？
见贤思齐
那么想要完成这样的研究，需要哪些知识和技能呢？
- 对于研究的背景，要有清楚的认知，哪些做过，哪些没有，哪些做得还不够深入，哪些切入点还探索较少？
- 要有娴熟的数据分析技巧和高超的绘图能力，这也是高分文章的共性，一图胜千言！
- 画出图的前提是要有数据，那么数据从哪里来？第一个自己去做测序，第二个就是使用公开的数据。不管是来源于哪里的数据，一定一定都需要第二点技能的支持。
我们再回过来看一看这篇文献，内容很多
但是仔细阅读一下大家就可以发现，这些都是由几个关键步骤串联起来的，总结一下就是：
- 细胞分群和注释
- 细胞再分亚群
- 不同亚群的功能差异
- 结合临床特征
那么掌握这些技能我们是不是也能重现这篇文章中的分析呢？当然可以！
针对大家对于单细胞分析的强烈需求，科研猫团队为大家推出了一套挖掘单细胞数据的金牌教程，涵盖但不限于：
单细胞转录组实战
环境搭建，R语言入门
1.R语言初探，R入门
2.如何安装R包, 有哪些注意点以及技巧
3.单细胞分析必须的R包
4.不同R包数据存储，对象特点
数据质控
1.质量控制的意义何在
2.质控包括哪些方面
3.如何提取质控后的细胞
数据获取、合并、降维、聚类
1.如果在公共数据库获取数据
2.数据合并、批次矫正
3.几种常见的矫正方法
4.主成分、聚类以及可视化
细胞注释
1.Marker的选择
2.自动化注释细胞
3.没有marker怎么办，肿瘤细胞的注释，inferCNV，copykat的使用
4.可视化技巧
分群再分群
1.为什么要再次分群，何时终止
富集分析
1.GO、KEGG、GSEA
2.绝对需要掌握的技能，给你的细胞打打分！
细胞间相互作用
1.常用工具介绍
2.cellchat的使用
3.nichenetr的使用
结合表型数据
1.TCGA是什么
2.如何结合已有的临床数据，有哪些切入点
课程内容丰富，最关键的是，从高分文献实例出发，不像其他课程一样，教你跑一边流程，而是让你切身掌握顶级的单细胞分析技能。哪怕你是零基础，相信我们的保姆级课程，也可以让你轻松掌握。
