2022年3月2日，Nature 杂志发表评论，对同期文章 Structure determination of high-energy states in a dynamic protein ensemble 进行了解读。
以下是全文内容。
前言
蛋白质存在不稳定的高能状态，这些状态只存在几分之一秒，但可以发挥关键的生物作用。一种使用核磁共振确定这种状态的高分辨率结构的新方法，揭示了蛋白质形状的微小变化对其功能至关重要。
问题
蛋白质具有动态的"个性"：它们不断地在更稳定的低能量状态和不稳定的瞬时高能量状态之间移动。它们的许多可能的配置可以被看作是一个能量景观。以高分辨率确定蛋白质结构的方法主要捕获常见的最低能量状态，但这导致了对蛋白质如何折叠和功能的不完整理解。高能构象通常是活性物质，但由于它们稀有且寿命短，因此难以研究。因此，结构生物学的一个挑战是扩大确定这些高能状态的方法。目前确定蛋白质结构的技术，包括X射线晶体学和低温电子显微镜，都具有局限性。
溶液核磁共振（Solution nuclear magnetic resonance）方法，特别是一种叫做Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）的弛豫色散技术（relaxation dispersion），已经被开发出来，用于量化蛋白质构象变化时的动力学和热力学。然而，对于大多数系统来说，确定相应的高能结构仍然是不可能的。一种解决高能状态的通用方法将大大增加对原子分辨率蛋白质功能的理解，并为复杂的蛋白质功能的合理设计打开大门。
解决方案
在核磁共振中，蛋白质中的每个原子都可以通过其原子核在磁场中的共振频率来检测，这称为化学位移。但仅仅测量化学位移并不足以准确计算蛋白质结构。然而，结构可以用假接触位移（pseudocontact shifts, PCSs）来计算：由单个顺磁性金属离子的结合引起的化学移位的变化。这是可能的，因为PCS取决于每个核相对于金属结合点的方向和距离。这种方法以前被用来确定蛋白质的主要结构，但我们将其与 CPMG 弛豫色散（PCS-CPMG）结合起来，以确定蛋白质在其高能状态下的 PCS。我们开发了一种半自动的方法，准确地解决了高能结构，并同时揭示了蛋白质改变状态的过程中的种群和动力学，从而描述了整个自由能景观。
我们将这一方法应用于腺苷酸激酶，该酶催化对供应细胞能量至关重要的反应（图1），并确定了一个关键但以前难以捉摸的高能状态，该状态为结合底物和释放产物做好准备。进入这种状态涉及到蛋白质中两个关键特征的一个惊人的小开口：AMP lid 和ATP lid（图1），突出表明这种方法可以非常准确地确定小的结构变化。这种高能结构也解决了关于限制酶催化速率的构象变化的长期争议。为了证明这种方法的普遍用途，我们展示了 PCS-CPMG方法所需的顺磁性金属可以通过镧系元素结合标签纳入任何蛋白质的方法。这些结果证明了我们的方法的通用性，以及它在确定蛋白质的大型构象变化方面的能力。
图1｜确定高能态结构的方法。腺苷酸激酶催化循环中限速步骤的简化自由能景观（相应的过渡状态用双小刀表示），说明了已知的主要结构和稀疏的未知次要结构。蛋白质结构显示了酶的特征：核心（棕褐色），以及AMP lid（蓝色）和ATP lid（红色），它们都需要移动以使底物结合和产物释放（以灰色显示）。由结合的顺磁性金属（绿色球体）产生的顺磁性等球体说明了使用假接触移位（PCS）来高分辨率地测量每个核的位置的次要的、高能的状态的想法。
未来的方向
当我们的方法与 AlphaFold 在使用人工智能预测蛋白质结构方面取得的令人印象深刻的进展结合使用时，就有可能描述蛋白质的整个自由能景观。
首先，AlphaFold将被用来预测一个蛋白质的最低能量的原子结构，然后我们的方法将使用这些起点来确定高能量状态的结构，相应的群体和他们从一个状态转换到另一个状态的速度。因为这种方法将在溶液中的蛋白质上进行，可以用来直接研究它们的作用。
这种方法仅限于确定存在于微秒至毫秒时间尺度上的高能状态的结构，以及低于一定大小的蛋白质。将PCS约束与化学交换饱和转移实验（chemical exchange saturation transfer experiments, CEST）相结合，可以提供一种类似的方法来确定更长时间尺度上的高能结构。最终，在数据库中加入高能结构可能会扩大 AlphaFold 预测高能状态的能力。
--Dorothee Kern(论文通讯作者) 布兰代斯大学/霍华德-休斯医学研究所
为了理解生物分子在溶液中的行为，我们需要描述许多相互转换的构象的动态组合，其中一些可能具有关键的生物作用。这种状态在原子水平上特别难以描述，因为它们数量少且寿命短。这项工作概述了一种确定蛋白质中这种瞬时结构的新策略。
--Hashim Al-Hashimi 美国北卡罗来纳州达勒姆的杜克大学医学院生物化学系
这篇论文的背后
大约20年前，我意识到最具生物活性的蛋白质构象是高能状态，而不是充满蛋白质结构数据库的低能结构，这个想法最初遇到了阻力。但方法的发展意味着这些稀疏的状态（只占蛋白质群体的0.1%）可以被揭示。从那时起，我的目标是确定它们的结构，但由于化学位移与结构之间存在巨大的不确定性，使用它们的化学位移的努力受到了阻碍。经过我的研究小组的不懈努力，才表明有可能改用高能态的PCS，而且该技术可以确定存在于几分之一秒内原子分辨率的蛋白质的结构。
--Dorothee Kern(论文通讯作者) 布兰代斯大学/霍华德-休斯医学研究所
编者的话
这项研究吸引了我的注意，因为这种核磁共振方法能够对低丰度、瞬时、高能状态的蛋白质进行高分辨率的结构测定，这在以前是很难捕捉的。该技术还可用于较小的蛋白质，对于这些蛋白质，低温电子显微镜方法尚不可靠，尽管它们在大部分结构生物学领域中占主导地位。这些状态是催化作用的本质，因此这种方法为理解酶的机制打开了大门。
--Angela Eggleston，Nature杂志生物学部团队主管
参考资料
doi: https://doi-org.javeriana.80599.net/10.1038/d41586-022-00531-7
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