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注 | 以上操作指南中涉及的消化酶以及实验方法仅供参考，实际应用过程中请根据具体情况进行细节上的调整。
肾脏组织背景介绍
肾脏为成对的扁豆状器官，红褐色。肾脏一侧有一凹陷，叫做肾门，它是肾静脉、肾动脉出入肾脏以及输尿管与肾脏连接的部位。肾表面包由被膜，由结缔组织构成，又称肾纤维膜。由肾门凹向肾内，有一个较大的腔，称肾窦。肾窦由肾实质围成。肾脏内部的结构，可分为肾实质和肾盂两部分。在肾纵切面可以看到，肾实质分内外两层：外层为皮质，内层为髓质。肾皮质位于肾实质表层，富含血管，新鲜时呈红褐色，由一百多万个肾单位组成。每个肾单位由肾小体和肾小管所构成，部分皮质伸展至髓质锥体间，成为肾柱。
肾单位是肾脏结构和功能的基本单位，由肾小体和肾小管所构成。肾小管汇合入集合管，肾小体包括肾小球和肾小囊。每个肾小体均有两个极，血管出入称血管极，相对的一端与近端小管曲部相连，称为尿极。泌尿小管之间的结缔组织称肾间质。皮质内间质较少，髓质内增多。间质内的纤维主要有I型、III型和VI型胶原蛋白组成。I型胶原蛋白分子上结合着糖胺聚糖，构成带状的胶原纤维。III型胶原蛋白形成网状纤维，位于泌尿小管周围。VI型胶原蛋白参与构成基膜。基质主要由糖胺聚糖和间质液组成。
该方案中使用4型胶原酶和A型胶原酶混合后的混合酶液。因为胶原酶提供广泛的蛋白水解活性，但优先切割细胞膜外的蛋白，所以基本上保持细胞完整，此外在消化酶液中，有来自大豆的胰蛋白酶抑制剂，旨在限制胶原酶混合物中胰蛋白酶蛋白的活性（会破坏细胞的完整性）。除了DNAse外，还有5 mM CaCl2（一种胶原酶活性的激活剂），可以消化死细胞释放的DNA，减少细胞结块。
肾脏组织及组织示意图
材料和试剂耗材
1.仪器耗材
2.胶原酶混合液配制
实验流程
- 将肾脏组织转移至预冷的PBS缓冲液中。
- 继续在冰上操作，将预冷的手术刀片或剪刀将肾脏组织切割成1 mm3左右的组织小块。
- 将10 mg左右已切碎的肾组织放在培养皿中，然后转移到1.5 mL试管中，加入1 mL混合酶液，混合酶液必须先放在冰上进行预冷。
- 每1 min晃动一次试管，从第2分钟开始每3分钟研磨10次。可将枪头前端用剪刀剪成宽口枪头，移液枪调至700 µL。
- 在冰上孵育30 min后，转移到冰上沉淀1 min
- 去除80 %左右体积的上清液，并将剩下的液体直接用30 μm的滤膜过滤，并用5 mL左右预冷的4 % PBS/BSA清洗过滤器
- 洗脱下来的液体（含有细胞）转移到15 mL大号离心管中，并同时添加预冷的0.04 % PBS/BSA至总体积为10 mL。
- 冷冻离心机4℃，650 g离心5 min后，去除上清液，将细胞重悬于10 mL的4 % PBS/BSA，并置于冰上。
- 向含有组织块的试管中添加额外的1 mL混合酶液。每3 min研磨10次，每分钟摇动一次，同时在冰上孵育
- 50 min后（总计1 h 20 min），将全部体积的消化混合液通过新的30 μm滤膜，过滤至50 mL的离心管中，用5 mL预冷的0.4 % PBS/BSA冲洗过滤1-2次
- 将液体转移至15 mL锥形管。用0.04 %预冷的PBS/BSA将体积调到10 mL。将此管和前一层的管（两个管）离心（650 g，5 min，4℃），去除上清液。
- 如果组织含有大量的红细胞，需要加入美天旎裂红试剂盒（Miltenyi Red Blood Cell Lysis Solution，货号130-094-193）进行裂红操作，具体操作参照试剂盒说明。
- 4℃，650 g离心5 min，去除上清，只留下100 μL体积
- 加入0.04 %预冷的PBS/BSA至10 mL，4℃下650 g离心5 min，尽可能多的去除上清
- 在冰上，用100 µL预冷的0.04 % PBS/BSA重悬细胞悬液，然后取适量悬液，采用台盼蓝或荧光计数法对细胞数量和活性进行检测
结果展示
所获细胞悬液：活率大于93 %，结团率较低，背景干净。
注：肾脏组织较脏，在解离过程中注意清洗干净，同时肾脏中线粒体比例相对较高，解离过程中如细胞量足够最好做去死细胞处理。
