单细胞研究中细胞类型注释是很重要的环节，大致分为人工注释和软件注释。
（1）人工注释需要借助文献检索marker或者结合常用的注释数据库-
cellMarker（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker/），
PanglaoDB（https://panglaodb.se/），
CancerSEA（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）等，比较考验研究者的相关背景和精力，优点在于准确性相对较好。
（2）软件自动化注释一般是使用软件内置数据集进行注释，操作相对简单。但是准确性会相对稍差，不过可以作为一种很好的辅助注释手段。
自动化注释的软件很多，本次先简单的分享如何使用singleR进行自动注释。
SingleR是一个用于对单细胞RNA-seq测序（scRNA-seq）数据进行细胞类型自动注释的R包（Aran et al.2019）。依据已知类型标签的细胞样本作为参考数据集，对测试数据集中的细胞进行标记注释。
一 内置数据库
使用SingleR的最简单方法是使用内置参考对细胞进行注释。singleR自带的7个参考数据集，其中5个是人类数据，2个是小鼠的数据： BlueprintEncodeData Blueprint (Martens and Stunnenberg 2013) and Encode (The ENCODE Project Consortium 2012) （人） DatabaseImmuneCellExpressionData The Database for Immune Cell Expression(/eQTLs/Epigenomics)(Schmiedel et al. 2018)（人） HumanPrimaryCellAtlasData the Human Primary Cell Atlas (Mabbott et al. 2013)（人） MonacoImmuneData, Monaco Immune Cell Data - GSE107011 (Monaco et al. 2019)（人） NovershternHematopoieticData Novershtern Hematopoietic Cell Data - GSE24759（人） ImmGenData the murine ImmGen (Heng et al. 2008) （鼠） MouseRNAseqData a collection of mouse data sets downloaded from GEO (Benayoun et al. 2019).鼠）
二 数据库，R包
2.1 singleR包安装
代码语言：javascript复制#if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))# install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("SingleR")
BiocManager::install("Seurat")2.2 加载数据集，数据
加载数据库，可能会比较慢。建议下载好数据库后进行保存。
代码语言：javascript复制library(SingleR)library(celldex)
library(Seurat)
library(pheatmap)
##下载注释数据库
hpca.se <- HumanPrimaryCellAtlasData()
hpca.se
#直接load下载好的数据库load("HumanPrimaryCellAtlas_hpca.se_human.RData")load("BlueprintEncode_bpe.se_human.RData")后台回复“注释”即可获取注释数据库以及测试数据的Rdata文件。
2.3 查看seurat结果
使用单细胞工具箱|Seurat官网标准流程得到的pbmc的seurat的结果，
（1）查看seuret聚类结果
代码语言：javascript复制load("pbmc_tutorial.RData")pbmc
meta=pbmc@meta.data #pbmc的meta文件，包含了seurat的聚类结果
head(meta)
orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt percent.HB RNA_snn_res.0.5 seurat_clusters labelsAAACATACAACCAC-1 pbmc3k 2419 779 3.0177759 0 0 0 T_cellsAAACATTGAGCTAC-1 pbmc3k 4903 1352 3.7935958 0 3 3 B_cellAAACATTGATCAGC-1 pbmc3k 3147 1129 0.8897363 0 2 2 T_cellsAAACCGTGCTTCCG-1 pbmc3k 2639 960 1.7430845 0 1 1 MonocyteAAACCGTGTATGCG-1 pbmc3k 980 521 1.2244898 0 6 6 NK_cellAAACGCACTGGTAC-1 pbmc3k 2163 781 1.6643551 0 2 2 T_cells（2）查看umap和tsne图
代码语言：javascript复制plot1 <- DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE)
plot2<-DimPlot(pbmc, reduction = "tsne",
label = TRUE)
plot1 plot2
三 singleR注释
3.1 singleR使用内置数据集注释
代码语言：javascript复制#进行singleR注释
pbmc_for_SingleR <- GetAssayData(pbmc, slot="data") ##获取标准化矩阵
pbmc.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = hpca.se, labels = hpca.se$label.main) #
pbmc.hesc
#seurat 和 singleR的table表
table(pbmc.hesc$labels,meta$seurat_clusters)
3.2 绘制umap/tsne图
代码语言：javascript复制pbmc@meta.data$labels <-pbmc.hesc$labels
print(DimPlot(pbmc, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),reduction = "umap"))
3.3 使用多个数据库注释
使用BP和HPCA两个数据库综合注释，使用list函数读入多个数据库
代码语言：javascript复制pbmc3 <- pbmcpbmc3.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = list(BP=bpe.se, HPCA=hpca.se),
labels = list(bpe.se$label.main, hpca.se$label.main))
table(pbmc3.hesc$labels,meta$seurat_clusters)
pbmc3@meta.data$labels <-pbmc3.hesc$labels
print(DimPlot(pbmc3, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),reduction = "umap"))
可以看到多了一些hpca没有注视到的细胞类型。
四 注释结果诊断
4.1 基于scores within cells
print(plotScoreHeatmap(pbmc.hesc))
细胞在一个标签的得分很显著的高于其他标签得分，注释结果比较清晰。
4.2 基于 per-cell “deltas”诊断
plotDeltaDistribution(pbmc.hesc, ncol = 3)
Delta值低，说明注释结果不是很明确。
4.3 与cluster结果比较
代码语言：javascript复制tab <- table(label = pbmc.hesc$labels, cluster = meta$seurat_clusters)
pheatmap(log10(tab 10))
参考资料:
https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/SingleR/inst/doc/SingleR.html
