00 文献信息
英文标题： A Single-Cell Immune Atlas of Triple Negative Breast Cancer Reveals Novel Immune Cell Subsets
期刊：《bioRxiv》
发表时间： 2019-07
研究领域： 乳腺癌 单细胞（BGISEQ-500)
DOI： https://doi.org/10.1101/566968
01 总述
三阴性乳腺癌(TNBC)是最具侵袭性的乳腺癌亚型，研究人员对TNBC免疫景观进行了深入分析。
研究人员从14例naïve TNBC肿瘤患者中分离了9683个肿瘤浸润免疫细胞，并进行单细胞转录组测序，共获得了22个免疫细胞亚群，包括T细胞、巨噬细胞、B细胞和DC细胞。
研究人员还发现了一个与低生存率相关的新T细胞亚群：CD8 CXCL8 naïve T cell。并且发现TCR 巨噬细胞组成的新免疫细胞亚群广泛分布于TNBC肿瘤中。进一步分析显示免疫细胞中与TCR信号通路和细胞毒性相关的分子上调，表明TCR信号通路被激活。
综上，该文献展示了免疫细胞治疗naïve TNBC肿瘤的单细胞转录组图谱，揭示了新的免疫细胞亚群。
02 数据
单细胞数据是由 BGISEQ-500 以 SE100 single-end mode进行测序的。
单细胞RNA测序数据存放于：（CNSA：https://db.cngb.org;登录号：CNP0000286）但未公开；
研究人员还使用了METABRIC 数据
03 结果
Tumor Characteristics and Single-cell Transcriptome Profiling of Immune Cells
为了在TNBC中揭示免疫系统的复杂性，研究人员根据CD45的表达情况，对14例Naïve TNBC患者的原发性肿瘤免疫细胞进行了深度单细胞RNA测序。经过质控后，共获得了9683个CD45 细胞。
The Immune Landscape of TNBC
研究人员使用Seruat方法对CD45 细胞进行无监督聚类分析，获得22个细胞簇，并通过t-SNE可视化，通过免疫细胞标志基因识别细胞亚群并命名了 T cells, B cells, macrophages and DCs。并通过免疫组织化学染色证实了CD8 T细胞，CD4 调节T细胞，B细胞和巨噬细胞。两个DC簇可以进一步分类为表达CD1C和Dectin 1（CLEC7A）的一种经典DC子集，以及特异性表达IL3RA和CD303（CLEC4C）的一种血浆型DC子集。
Subtype Analysis of Tumor Infiltrated T cells
T淋巴细胞是实体肿瘤微环境中最丰富、研究最充分的免疫细胞群。研究人员研究了TNBC肿瘤中浸润T细胞的特征。CD45 无监督聚类分析获得了9个T细胞簇，包括3个CD4 T cell，6个CD8 T细胞。
CD8 细胞细分：
通过已知T细胞功能标记基因的表达情况和簇间差异基因(DEGs)的表达，揭示了T细胞簇间的不同特征。
naïve T cell （CCR7, SELL, and LEF1）：T2,T4细胞簇；
exhausted T cell（ HAVCR2 (TIM-3), TIGIT, and LAG3）：T1和T6
cytotoxic T cell（IFNG、PRF1、GZMA 和 GZMB）：T3和T5
CD4 细胞细分：
T7和T9表现出显着的调节性T细胞（Treg）特征：FOXP3和IL2RA (CD25)高表达。簇T8 高表达CXCL13，CD200，BTLA，PDCD1（PD-1）和CTLA4，与dysfunctional T helper cell （TH）特征一致。
Genes Uniquely Expressed by Exhausted CD8 T Cells and Tumor-infiltrated Tregs in TNBC
目前的免疫检查点阻断疗法主要针对衰竭的CTL或Treg。为了发现TNBC免疫治疗的潜在治疗靶点，研究人员试图研究这两种免疫抑制T细胞亚群唯一表达的基因。
研究人员利用Limma包对exhausted CD8 clusters和non-exhausted clusters 进行差异分析，获得了114个差异基因（adjusted P < 0.01 and log2FC ≥ 1）。包括23个已被证明的exhaustion markers。
值得注意的是，肿瘤浸润的CD8 T细胞低表达PDCD1(PD-1)，但高表达了其他耗竭标志基因。并且T1簇还具有tissue-resident memory T (TRM) 细胞特征。
TRM marker genes： CD69, ITGAE (CD103) and ITGA1
研究人员对肿瘤浸润Treg细胞进行了相同的分析，并发现TNBC的Treg特异性基因和其他肿瘤的Treg特异性基因有很多相同。
Pseudotime State Transition of T cells and a “Pre-exhaustion” T Cell Subset
伪时序分析可以提供T细胞发育轨迹。为了探测TNBC中的T细胞功能状态转换，研究人员使用Monocle2算法基于转录相似性对CD8 和CD4 T细胞进行伪时间分析。
CD8 T 细胞轨迹从naïve clusters T2 and T4 两个分支开始，分别经过细胞毒性簇T3和T5，最后到exhausted clusters T1 and T6。
该轨迹显示，T5似乎是位于细胞毒性簇和细胞衰竭簇的一种中间状态。对T5和T3进行差异分析显示有259个基因表达升高，包括衰竭标记基因CTLA4、HAVCR2和TIGIT。
生存分析显示高表达T3或T5的患者生存率较高，而仅高表达T3或仅高表达T5的患者其生存率无差异。
CD4 T细胞的分化轨迹：Treg簇T7和T9位于exhausted 的Th簇T8的另一端。
Clonal Enrichment of Exhausted T Cells and Tregs in TNBC Microenvironment
TCR分析为深入了解T细胞的各种状态提供了另一种方法。TCR序列的多样性是识别病毒抗原或由抗原呈递细胞(APCs)上的主要组织相容性复合体(MHC)呈现的肿瘤特异性新抗原的关键。
研究人员通过TraCeR方法基于组装的全长TCRα和β序列来跟踪每个T细胞的谱系。从14例患者的3315个T细胞中获得具有α和β链的全长TCRs，其中2311个具有独特的TCRs, 1004个重复使用TCRs，表明存在克隆扩增。
在不同的T细胞簇中检测到不同程度的克隆扩增。在naïve细胞群(T2和T4)中，只有大约10%的CD8 细胞具有克隆性TCR，而在衰竭CD8 T细胞群(T1和T6)中超过30%。CD4 T细胞的Treg簇和TH簇分别有17.82%和30.61%的克隆扩增。
鉴定克隆TCR验证了TNBC微环境中不同T细胞簇的激活和衰竭状态。
A CXCL8 Producing CD8 Naïve T Cell Subset Associated with Survival
CXCL8主要来源于骨髓细胞和上皮细胞，先前的研究表明，人脐血CD4 naive T细胞可以表达CXCL8，但在成人中很少产生CXCL8的T细胞。但研究人员在T2簇中发现了CD8 CXCL8 naïve T cells，且在14例样本中有10例存在。
研究人员通过生存分析发现CD8 CXCL8 naïve T cell 具有促肿瘤的作用。
为了研究 CD8 CXCL8 naïve T cells的潜在机制，研究人员利用METABRIC 数据对T2高低表达的肿瘤进行了差异分析。结果显示T2高表达组有75个基因高表达。研究人员对这些高表达基因进行GO富集分析，结果发现其普遍富集于白细胞(包括粒细胞和髓系白细胞)趋化和迁移途径中，并且MAPK和ERK1/ERK2 cascades被激活。
这些结果表明 CD8 CXCL8 naïve T cells可以通过介导白细胞迁移到肿瘤部位并激活MAPK/ERK途径来促进癌症进展。
Characterizing and Clustering of DN T cells in TNBC Microenvironment
CD3 /CD4-/CD8-double negative (DN) T cells 已被证明可以在炎症和自身免疫中发挥作用。并且DN T细胞占总T细胞的31.0% 无监督聚类显示DN T细胞有三个聚类。
C1高表达细胞毒性标志物GZMA、GZMB和IFNG (IFN-γ)。C2高表达FOXP3、IL2RA和CTLA4。C0为CCR7高表达的 naïve-like 簇。
基于TCR的分析显示，68.5%的DN细胞至少存在一对可产生α-β链，2.4%的DN细胞存在成对可产生γ-δ链。总共有71对TCR与CD4 T细胞共享，31对TCR与CD8 T细胞共享，52对TCR发生在DN T细胞内。
上述DN T细胞的高比例和多样化的亚型表明，这种被忽视的T细胞可能在TNBC免疫中具有重要的功能。
Characterization of TAM subpopulations in TNBC
对于TNBC中的巨噬细胞的分类，研究人员首先应用了经典的巨噬细胞极化模型。基于激活状态，巨噬细胞可以被识别为anti-tumoral classically activated (M1) cells and pro-tumoral alternatively activated (M2) cells。研究人员鉴定的所有巨噬细胞中，M1和M2标记基因表达高度正相关。
研究人员使用Seruat将巨噬细胞分为六个亚群，每个簇具有唯一表达基因（图5B）。
Identification and Confirmation of TCR Macrophages in TNBC tumors
研究人员发现一个巨噬细胞亚群特异性表达T细胞标记物CD3，以及TCRα/β链的恒定区域，表明该亚群是α/β TCR 巨噬细胞（或TCR 巨噬细胞）。
进一步证实这些巨噬细胞表达了可以发挥抗原识别功能的成对生产TCR，研究人员通过scRNA-seq数据重建了巨噬细胞中的TCRs。并在14例患者中的13例中鉴定出382个具有成对生产α和β链的TCR 巨噬细胞，占巨噬细胞总数的14.28%。Mφ1至Mφ6簇中TCR 巨噬细胞的百分比范围为1.97％至19.67％。但它们与其他巨噬细胞聚集而非T细胞。TCR 巨噬细胞的CD3和TCR基因的表达水平在T细胞和巨噬细胞之间，而巨噬细胞标记物具有与巨噬细胞中相似的表达水平（图5D）。并且与已有的研究相比，发现TCR 巨噬细胞更类似于单核细胞和巨噬细胞，并且与T细胞，B细胞和NK细胞有显着不同。
随后，研究人员试图验证TCR 巨噬细胞的存在。经过Sanger测序并和TCRα/β链进行比较，并结合免疫荧光检测确定了TCR 巨噬细胞的存在。
并且通过FACS分析，发现肿瘤浸润的CD68 细胞中分别有26.58%和25.96%同时表达CD3和TCR(图5f)。综上所述，这些结果再次证实了TNBC微环境中存在TCR 巨噬细胞亚群。
Potential Function of TCR Macropahges Revealed by Uniquely Expressed Genes and TCR-based Analysis
为了揭示TCR 巨噬细胞的潜在功能，研究人员分析了TCR 巨噬细胞与TCR巨噬细胞的差异表达基因。
LCK、LAT、FYN和ICOS，是T淋巴细胞中TCR信号传导所必需的 GZMA和GZMB，参与了细胞毒性效应。
基因集富集分析显示，TCR 巨噬细胞中上调的基因富集于TCR信号通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路。
上述结果说明TCR信号实际上可能在TCR 巨噬细胞中被激活。
为了验证TCR 巨噬细胞中TCR信号传导的激活，研究人员检查了ZAP-70的磷酸化状态（控制TCR信号通道激活的主开关）。并在多个TNBC患者的肿瘤标本中观察到TCR 巨噬细胞中磷酸化的ZAP-70(图6d)。
这些结果表明，部分TNBC巨噬细胞不仅可以表达TCR，还可能转导TCR下游信号，从而具有激活T细胞功能相关基因表达的潜力。
研究人员还研究了TCR 巨噬细胞的TCR库。总共鉴定了361个TCR克隆型。16个由至少2个巨噬细胞组成TCR 巨噬细胞克隆，表明TCR 巨噬细胞也表现出克隆扩张。并且研究人员发现大量TCR 巨噬细胞与T细胞共享TCR。共鉴定了在TCR 巨噬细胞和CD4 /CD8 T细胞之间共享的61个TCR Clonotypes，其中7也存在于巨噬细胞克隆中。并且研究人员鉴定的11种TCR对，不仅在巨噬细胞和T细胞中共存，而且还在患者TNBC010和TNBC012中共存，表明它们可能识别常见的抗原。
研究人员探索了TCR 巨噬细胞靶标的抗原。
肿瘤微环境中存在CD8 TILs，其TCRs只能识别与癌症无关的表位。为了探讨巨噬细胞表达的TCR是否包括识别肿瘤抗原的TCR和识别与癌症无关的TCR，研究人员分析了CD8 TILs和巨噬细胞共有的TCR。
根据4-1BB和CD39的表达情况，研究人员将CD8 克隆分为4组：4-1BBhighCD39high, 4-1BBhighCD39low, 4-1BBlowCD39high, and 4-1BBlowCD39low。由于CD8 TILs不表达CD39，并且活化的T细胞通常表现为4-1BB高表达，研究人员推测4-1BBhighCD39high CD8 T细胞可能被肿瘤抗原识别并激活，而4-1BBlowCD39low T细胞则不会。
研究人员发现，在上述两组中，有T细胞与巨噬细胞共享TCRs，表明由巨噬细胞表达的TCRs可能包括识别肿瘤抗原和不识别的两种。
