3月30~31日，由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室主办的2018基因编辑学术研讨会将在京举行。届时众多一线科研工作者将聚集于此共襄学术盛宴。
2018基因编辑技术期待进展一览
王皓毅 中国科学院动物研究所
CRISPR-Cas9在动物模型构建、T细胞治疗以及基因表达调控中的应用 高效精确的基因工程技术对于发展基因治疗，建立细胞和动物疾病模型具有极为重要的价值。近年来特异性定点核酸酶的研究取得了长足的进步。为了突破传统基因打靶方法的局限，我们率先通过受精卵注射CRISPR-Cas9一步获得多基因敲除的小鼠。为了取代低通量且技术要求极高的显微注射技术，我们建立了受精卵电击的方法，从而极大简化了动物模型的构建。这一系列工作大大提高了基因修饰小鼠构建效的率和速度，为疾病和发育生物学的体内研究提供了重要的工具。同时我们在原代T细胞和表达嵌合性抗原受体的T细胞（CART）中建立了高效的单基因和多基因敲除技术，为细胞免疫治疗研究提供了工具。除了基因编辑，我们也基于CRISPR-Cas9系统建立了新技术，用来调控基因的表达水平和表观遗传修饰状态。
王艳丽 中国科学院生物物理研究所
Cas13a 切割RNA的分子机制
CRISPR/Cas系统是原核生物抗免疫防御系统，是近年来发现的由小分子RNA介导的免疫系统。CRISPR-Cas系统分为两大类，Cas13a是第二大类VI型系统中的效应蛋白，亦称C2c2，具有RNA介导的RNA酶切活性，是目前第二大类CRISPR-Cas系统发现的唯一能够降解RNA的蛋白，在RNA技术中具有潜在的应用价值，对开发研究RNA工具，扩展CRISPR系统在基因编辑方面的运用具有重大价值。 为了研究Cas13a如何被激活来切割RNA，我们解析了与crRNA及其靶RNA结合的Leptotrichia buccalis（Lbu）Cas13a的晶体结构，以及LbuCas13a-crRNA复合物的cryo-EM结构。研究结果揭示了crRNA-靶RNA双链体结合在核酸酶（NUC）叶片的带正电的中心通道中，并且Cas13a蛋白和crRNA在靶RNA结合后发生显着的构象变化。指导目标RNA双链体形成触发HEPN1结构域向HEPN2结构域移动，激活Cas13a蛋白的HEPN催化位点，其随后以非特异性方式裂解单链靶标和旁系RNA。研究结果证实targetRNA的结合导致LbuCas13a的两个HEPN结构域发生构象变化，从而激发LbuCas13a非特异性地切割任意单链RNA的酶切活性，该成果为研究Cas13a发挥RNA酶活性的分子机制提供了重要的结构生物学基础。该研究的发现为CRISPR-Cas13a系统的进一步开发提供了可靠的结构基础，对深入理解细菌抵御病毒入侵的分子机制提供了强有力的证据，并将对病毒引起的疾病的预防、检测、控制与治疗产生重大意义，特别是基于Cas13a高效的RNA酶切活性，对其应用于各类重大疾病的快速检测具有十分广阔的前景。
吴强 上海交通大学
开发DNA大片段编辑技术研究染色质高级结构 源于细菌和古菌的Ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9]近年被改造成为基因组定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、费用低廉等巨大优势，给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。基于CRISPR/Cas9系统的基因组DNA片段靶向编辑技术主要包括DNA片段的删除、反转、重复、插入和易位等，这一有效的DNA片段编辑方法为研究基因功能、调控元件、组织发育和疾病发生发展提供了有力手段。我将着重汇报我们在该领域最新的研究CTCF等染色质架构蛋白在三维基因组组装调控的进展，为开展利用基因组DNA片段靶向编辑进行基因调控和功能研究提供参考。
周德敏 北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室
Manipulation of Viral Genome in Conversion of Life-ThreateningViruses as Precision Therapeutics The conversion of life-threatening viruses into live but avirulent vaccinesrepresents a revolution in vaccinology. In a proof-of-principle study, weexpanded the genetic code of the genome of influenza A virus via a transgeniccell line containing orthogonal translation machinery. This generated prematuretermination codon (PTC)–harboring viruses that exerted fullinfectivity but were replication-incompetent in conventional cells. Genome-wideoptimization of the sites for incorporation of multiple PTCs resulted in highlyreproductive and genetically stable progeny viruses in transgenic cells. Inmouse, ferret, and guinea pig models, vaccination with PTC viruses elicitedrobust humoral, mucosal, and T cell–mediated immunityagainst antigenically distinct influenza viruses and even neutralized existinginfecting strains. The methods presented here may become a general approach forgenerating live virus vaccines that can be adapted to almost any virus.
王永明 复旦大学
建立高效的CRISPR/Cas9编辑技术 CRISPR/Cas9是一项革命性的基因编辑技术，得到广泛应用。我们从两个方面着手提高CRISPR/Cas9的编辑效率。我们利用附着体载体表达Cas9和gRNA，称之为epiCRISPR技术。附着体载体不整合到基因组，但是可以随着细胞的分裂而复制，因而可以长期的表达外源基因，实现长期的基因编辑。同时在附着体载体上表达嘌呤霉素抗性基因，可以富集转染成功的细胞。编辑完成后撤除筛选药物，附着体质粒迅速丢失，编辑后的细胞不再表达外源基因。利用附着体技术可以实现高达100%编辑效率，还可以高效的敲除基因组大片段，以及同时敲除多个基因。CRISPR/Cas9编辑效率受gRNA序列影响，不同的gRNA效率差别很大，测试gRNA效率费时费力。我们建立了高通量的测试gRNA活性的方法，得到了5万多条gRNA的活性，覆盖了2万多个人类基因。这些工作将会极大的方便基因编辑工作。
常兴 中国科学院上海生命科学研究院
利用靶向性胞嘧啶脱氨酶进行基因编辑 单核苷酸的多样性是遗传多样性的主要来源，是人类个体差异的重要遗传学基础，同时也是分子进化的动力和很多疾病的直接诱因。然而，在哺乳动物中，仍然缺乏有效诱导单核苷酸的突变的工具，无法通过实验高效和高通量的地研究单核苷酸突变的功能。现有的大部分实验技术只能扰乱基因的功能或者表达，造成基因功能缺失，对诱导新功能的获得无能为力。而利用靶向性胞嘧啶脱氨酶介导的碱基编辑（TargetedAID-mediated mutagenesis ,TAM）技术，可以在sgRNA靶向的基因组DNA上，将胞嘧啶和鸟嘌呤随机地向其它三个碱基转变，因而产生海量的突变体，结合遗传筛选，从而分析单核苷酸突变的功能或诱导蛋白质的体内进化。同时在一种多肽抑制剂（UGI）的辅助下，dCas9-AID可以诱导特定的胞嘧啶向胸腺嘧啶转变，实现单碱基的精确编辑，为治疗单核苷酸突变诱导的遗传病提供方案。利用这项技术，已经在慢性骨髓瘤细胞中，成功筛选出已报道的以及新的imatinib耐药性位点。因此，作为高效的哺乳动物DNA碱基编辑新技术，TAM可以广泛应用于蛋白质工程，分子遗传学研究和基因治疗等领域。
朱洁广州市妇女儿童医疗中心
CRISPR-Cas9介导的光感受器细胞重编程治疗视网膜色素变性
基因治疗已经在多种人类疾病治疗中显示出巨大的潜能。然而目前的方法通常只针对单个基因或单个突变，使得对多基因或多点突变的疾病治疗受到极大限制。视网膜色素变性是临床常见的致盲眼病，极具临床和遗传异质性，是导致人类视力障碍最主要的疾病之一。目前已有超过40个基因和位点被报道与视网膜色素变性有关。这里我们采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法，对视网膜色素变性小鼠进行了基因治疗。通过突变视杆细胞中重要的转录因子Nrl或Nr2e3，将视杆细胞重编程为视锥细胞。转化后的视锥样细胞对突变引起的感光细胞退化不敏感，从而使小鼠在发病后期仍能保留一定程度的视力。我们的发现不仅为视网膜色素变性提供了新的不依赖于基因突变的治疗方法，而且证明了基因编辑技术介导的细胞重编程、细胞退化预防以及组织功能保护的巨大可能性。
杨辉，中科院上海神经所
基因编辑在疾病模型建立及疾病治疗中的应用
基因修饰动物是研究在发育和疾病中基因功能的重要工具。CRISPR/Cas9系统有效的应用于构建基因敲除和敲入小鼠。然而，该方法获得的基因修饰动物存在严重的嵌合体现象，即动物个体的一部分细胞被基因编辑，而另一部分则没有。通过交配方法获得纯合的基因敲除小鼠需要很长的时间和花费，这在获得多基因敲除小鼠中尤为明显。而由于猴子的生殖周期长（4-5年性成熟，半年怀孕期），生殖能力低（单胎动物），通过交配方法来获得纯合突变的基因修饰猴则需要更长的时间和花费。为此，我们通过优化CRISPR/Cas9系统，成功的在第一代就获得了单基因或多基因功能完全敲除的小鼠及猴，可以直接用于表型分析，极大促进了非人灵长类动物模型的建立及其在脑科学及脑疾病中的研究。同时我们设计了一种同源介导末端接合（HMEJ）策略，可以在分裂和非分裂细胞中均实现精确且高效的基因整合。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎或者体内的肝细胞和神经元中，该方法的效率均远高于以HR、NHEJ和MMEJ为基础的策略。因此，这种HMEJ策略可能具有多种运用性，譬如基因编辑来获得动物模型以及靶向基因治疗。 通过上述几种方法，我们可以有效的在猴中获得各种基因修饰猴模型。近期，我们目标获得的疾病猴模型包括PD，AD，ALS，DMD，RP，AS等，工具猴模型包括光遗传猴，各种神经元特异的Cre猴等。这些猴模型的建立将极大促进我们对人类疾病的了解和治愈。 此外，我们也致力于各种CRISPR相关工具的开发及优化，包括CRISPR激活系统，CRISPR标记系统，CRISPR介导的成体治疗等等。
马燕琳 海南医学院第一附属医院
基因编辑与生殖健康
基因编辑技术通过插入、缺失或替换的手段对基因组进行定点改造，既能够通过以突变基因代替正常基因来研究基因的功能，也能够以正常基因代替突变基因来进行基因治疗。近年来，有着“基因剪刀”之称的CRISPR/Cas9技术被认为是能够在活细胞中快速、准确地编辑目的基因的有效方法。随着人类在破译基因的遗传密码和基因编辑技术上的不断突破，通过修改基因从根本上治愈和预防疾病成为可能，特别是在单基因疾病的治疗上，基因编辑有着广阔的运用前景。就生殖健康方面而言，卵巢早衰这类由表观遗传引起的疾病目前只能通过替代治疗延缓症状，不能根治。CRISPR/Cas9技术的出现有望对表观遗传的靶点进行遗传编辑，改善生殖健康，也为生殖相关疾病提供了新的治疗思路。此外，利用基因编辑对胚胎特定基因集进行敲除操作，造成相应基因在胚胎中的缺失，可深入研究人类胚胎早期发育中的功能、作用机理，帮助人类了解生物体的基本功能，也可以推动人类健康事业的发展,从根源上清除遗传疾病。
张淑君 华中农业大学
建立和利用猪全基因组基因敲除CRISPR/Cas9技术筛选鉴定猪流感病毒感染相关的宿主（猪）基因
在猪PK15细胞系中，证实了CRISPR/Cas9系统在猪细胞系中能高效地诱导猪基因敲除。设计和构建了猪全基因组基因敲除CRISPR/Cas9文库，该文库包含了65316个gRNAs、覆盖了13229个基因，其中含有5个gRNAs的基因有11400个基因、含有4个gRNAs的基因有1829个，并且全部的基因都含有至少2个gRNAs（最多不超过5个gRNAs/基因）。利用该猪全基因组基因突变gRNAs文库进行大规模的基因筛选，初步筛选出了140个候选宿主基因，并证实了其中的32个候选基因在病毒复制增殖中具有一定的调控作用
周峰复旦大学生物医学研究院
利用dcas9和超高灵敏度蛋白质谱平台构建位点特异DNA-蛋白质互作网络 随着功能基因组学的飞速发展，对调控基因表达的顺式（cis-）和反式(trans-)作用元件进行系统研究成为当前急需填补的领域空白。利用生物素化的（biotinylated）功能缺失的dcas9系统加上能与我们所感兴趣位点能够形成特定结合的SgRNA，在原位去分离纯化我们感兴趣位点DNA以及与这个位点有特定结合的蛋白质复合物。我们利用该系统去研究在白血病细胞系K562中，与血红蛋白（Hemoglobin）的几个亚型HBB、HBG、HBE1、以及与调控相关的几个重要的增强子HS1、HS2、HS3、HS4和HS5上面所结合的蛋白质复合物。在该实验中，我们利用Streptavidin的免疫特异性树脂球对带有Biotin基团的蛋白质复合物进行纯化。然后进行了iTRAQ的标记，最后，样品由高灵敏度的全蛋白定量平台进行定量的分析。在该实验中，我们能够检测到如GATA1，TAL1，NFE2等与血红蛋白的表达息息相关的已知的转录因子。与此同时，我们也能发现新的蛋白质核孔蛋白NUP98以及NUP153结合在hemoglobin基因的位点上面。然后，我们利用该方法研究了跟疾病关系密切的位点，HBE1到HBD之间的区域。通过蛋白质组学，我们发现与HBD-1K相结合的蛋白质的数量要多于与HBD-1.5K以及HBD-2K的蛋白我们同时也测定了与这些位点有相互作用的DNA区域，我们也同样发现与HBD-1K相结合的DNA的数量要多于与HBD-1.5K以及HBD-2K的DNA数量。综合以上的证据，HBD-1K是一个重要的疾病相关基因，通过CRISPR技术敲除了HBD-1K之后，我们能够发现HBG的基因转录受到了明显的影响，而HBB的转录则大致不变。我们的技术表明了，我们能对特定的DNA区域，即使是对单拷贝的DNA位点能够进行全面深度的蛋白质复合物的解析。这些解析的结果能够帮助我们发现那些对特定基因起着重要调控作用的蛋白质，对研究这些基因的激活与静默机制有着至关重要的作用。
